[发明专利]基于氟化物修饰的树形高分子基因转染载体及其制备方法和应用

说明书

技术领域

本发明涉及高分子化学以及生物材料技术领域，具体涉及一种基于氟化物修饰改性的树形高分子的基因转染载体及其制备方法和应用。

背景技术

基因转染是指将外源基因导入细胞或组织并表达的过程。这种技术广泛应用于科学研究和疾病治疗。在这个过程中，基因转染载体扮演了很重要的角色。一般来说，基因转染载体主要可以分为两类：病毒类载体和非病毒类载体。利用病毒转染方法可以获得长期高效表达外源DNA的细胞或组织，但病毒类载体存在细胞株适用性，携带基因能力有限，容易引起细胞免疫反应以及安全性隐患等问题。目前安全，低毒，操作简便的非病毒基因转染方法受到了人们的广泛关注，包括聚丙烯亚胺(PEI)，聚精氨酸，L-聚赖氨酸(PLL)，脂质体等非病毒转染载体以及其经过修饰所得到的载体已经得到了广泛的研究。不过虽然这类方法提供了相对安全和较强可用性的基因转染方式，但是相对较低的转染效率和较高的细胞毒性限制了其在医学临床上的广泛应用。

聚酰胺-胺树形高分子(polyamidoamine，PAMAM)是Tomalia D.A.于1985年首次报道的具有几何分支的椭圆形结构的树形大分子。其高效低毒安全的特点已经在基因转染中被广泛研究和应用，得到了人们的广泛关注。1993年，Meijer等用外向发散法合成出来的聚丙烯亚胺(PPI)树形高分子首次实现了大规模合成和商业化，为树形高分子的广泛研究和应用奠定了基础。树形高分子的特殊结构使其易于结合基因质粒片段，并且其内部三级胺结构可以起到“质子海绵”的作用，促进其在细胞内涵体的逃逸行为，有效将确保基因不在细胞内的稳定性。近年来，将聚酰胺-胺以及聚丙烯亚胺树形高分子表面氨基进行化学修饰成为主要修饰形式之一。例如在表面氨基上共价连接环糊精、氨基酸、PEG等修饰基团，可以获得相对较好的基因转染效果。还有一类修饰方案是在聚酰胺-胺树形高分子表面氨基上修饰生物素、糖基、多肽片段和蛋白质等基团，可以使载体具有靶向转染效果。这些修饰方式可以优化增强聚酰胺-胺树形高分子基因转染效果同时提高细胞相容性。目前，以聚酰胺-胺树形高分子为基础的基因转染载体如和已经成功商业化应用。但是，基于树形高分子的基因转染载体有比较复杂的合成路线、高昂的材料成本以及高的细胞毒性，仍然是制约这些材料在生物医学领域广泛应用的主要因素。

为了解决这些问题，获得更好的转染效果以及生物相容性，我们制备了基于树形高分子表面化学共价修饰氟化物的基因转染载体。从以前的研究工作中我们了解到，在聚酰胺-胺树形高分子表面修饰疏水性分子可以提高转染功效。例如，在聚酰胺-胺树形高分子表面修饰脂质官能团，如Josél. Santos et al.2010报道，疏水基团促使基因复合物保持稳定，也可以帮助复合物从内涵体逃逸。氟化物作为一种修饰成分在之前较早的基因转染研究中已经体现了一定的优势，如Gaucheron et al.2001报道的在精胺脂(DOGS)分子上修饰含有氟烃基的脂肪链，能够提高精胺脂的转染效率。由于氟化物具有疏水和疏脂的性质，我们认为，氟化物修饰基团可以起到稳定结合的DNA，有效保护DNA并且促进基因复合物的细胞摄入和胞内内涵体逃逸，确保DNA分子高效表达。基于表面修饰的氟化物的特点，这类载体可以有效降低转染过程中其与基因复合转染时的氮磷比，其带来的作用既可以减少材料的用量，节省了细胞转染成本，又从而降低了细胞毒性，提高了基因转染载体的生物适用度。同时由于其疏水疏脂的性质，不易于蛋白结合，可以有效帮助避免血清中蛋白质干扰载体与基因的结合以及DNA的降解，因此这种基因转染载体可以在血清存在的条件下实现高效、低毒的细胞转染效果，不仅便于细胞转染实验的操作，还提高了细胞的存活率。这样可以有效解决目前商业化的转染试剂不能有效抗血清转染的问题(如Lipofectamine2000、Fugene等)。另外，这种氟化物部分表面修饰的树形高分子的合成工艺十分成熟并且操作简易，合成速度快，产率高，实验周期短，无需繁琐的纯化步骤即可快速获得高产率的基因转染载体，其简易的合成方法为其提供了商业化的良好基础。因此，这类部分氟化物表面修饰的树形高分子具有高效转染、低细胞毒性、简易的合成方法及高产率等优点，可以开发为一类新的基因转染材料并具有被商业化的潜力。我们将在分子、细胞水平揭示这类材料的转染机理，初步阐明这类材料结构与功能的关系，构建基于树形高分子的高效、低毒基因转染载体，并致力于将这类材料推向商业化，搭建一个成熟的基因转染平台。

发明内容