[发明专利]一种彩色立体区域共焦显微成像方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种显微成像技术，特别涉及一种彩色立体区域共焦显微成像方法。

背景技术

共焦显微镜从产生至今有了飞跃性的发展，随着科技的进步，各式各样的共焦显微镜被研制出来，在扫描方式越来越趋向现代科技化的同时，探测信息接收系统也越来越精确，使得仪器能够探测更小更精密的样品，也满足了时代的要求。 

激光共焦扫描显微技术是集新颖共焦原理、激光扫描技术和计算机图像处理技术于一体的新型显微技术，是一种典型的高新技术光电仪器。同普通显微镜相比，具有较高的横向分辨率和较好的轴向分辨率，而且可以通过对物体不同深度逐层扫描，获得大量断层图像，通过计算机处理合成三维立体图像。同电子显微技术相比，可以不必对样品进行切片，从而可以保留鲜活体样品进行动态观察，因而在生物、医学诊断、工业、农业、国防、科研、生命科学等领域都有广泛应用。

目前，已经出现了使用光子晶体光纤产生的超白光作激励光源的彩色共焦显微镜、三维数字共焦拉曼显微镜以及光纤耦合多路复用共焦显微镜等新型显微镜，实验室已经研究出多路频分复用荧光共焦显微系统，采用同轴电控变焦聚合物分散液晶，实现多通道频分复用荧光共焦方法，但是目前只能探测样品平面信息，还不能实现三维探测。目前，也有探测三维信息的共焦显微镜，但由于运用机械斩波，系统体积很大，而且不能实现真正意义上的三维测量，在分辨率和探测速度上都有问题存在。

发明内容

本发明是针对目前没有真正意义上的探测三维信息的共焦显微镜的问题，提出了一种彩色立体区域共焦显微成像方法，提出采用电控变焦聚合物分散液晶光栅，在实现频分复用的同时实现波分复用的共焦显微成像方法，实现对样品的实时三维探测。该系统采用全息聚合物分散液晶光栅阵列和微透镜阵列，具有集成式设计，便于控制，也减少了机械噪声和机器体积，提高了共焦显微镜的分辨率和速度。

本发明的技术方案为：一种彩色立体区域共焦显微成像方法，具体包括如下步骤：

1）搭建NíN通道波分频分调制激光光路：将飞秒激光器、光子晶体光纤、扩束镜、H-PDLC光栅阵列、消色散微透镜阵列、分束器、聚焦透镜、由透镜和变焦显微物镜阵列组成的望远镜成像系统依次同轴搭建起来，聚焦到样品上，将飞秒激光器发出的飞秒激光脉冲耦合到光子晶体光纤中得到白光超连续光谱，再耦合进扩束镜；扩束镜出射的光束到达NíN式H-PDLC光栅阵列上进行分光和不同频率的调制，分光调制好的光束通过消色散微透镜阵列，调整为平行光束射出，在空间形成不同波段光谱从上到下依次分布的平行光束，通过分束器使得平行光束一部分透过，一部分反射，透过分束器的平行光束经过聚焦透镜聚焦到轴上，聚焦光束经透镜和变焦显微物镜阵列聚焦到样品上；

2）搭建波分频分复用共焦显微镜的显微成像：样品反射回来的光束经过由透镜和变焦显微物镜阵列构成的望远镜成像系统，再经聚焦透镜后形成平行光束，经分束器反射进入到由消色散物镜、滤波板和物镜组成的滤波系统，其中消色散物镜的焦点和物镜的焦点都位于滤波板中心小孔处，滤波后的平行光束到达分束器，一部分透过被CCD摄像机接收，另一部分被分束器反射，被光电倍增管PMT接收；

3）信号采集及处理： CCD摄像机采集样品信息，并且将三维信息在平面上显示，光栅条纹水平于平台放置或者垂直于平台放置，相应的由NíN式H-PDLC光栅阵列分光后的不同波段光谱以从上到下的顺序或者从左到右的顺序分布，就可以分开记录样品的深度信息和平面信息，即将三维信息转换成平面信息进行记录，送入计算机中根据已检测的样品信息进行三维构建；通过变焦显微物镜阵列调焦，每一次变焦，得到一种波段的光谱探测结果，通过重复调焦操作，在这一位置能够得到不同波段的光谱的探测的结果，通过对比每一次调焦后CCD摄像机所得到的图像信息，找出这一位置探测到的光强最弱的光谱，则此光谱即为样品这一位置的颜色，对样品的每一个位置的探测图像都进行对比，则可以得到样品的颜色信息；光电倍增管PMT将探测到样品上一个深度方向的光强度信号总和进行光电转换，通过A/D转换器将信号输送到计算机，对具有不同频率的光谱进行解调，按各自的频率进行解调，将调制信号与具有相同载波频率的余弦信号相乘，再通过低通滤波器滤去多余的频谱，可以得到原始信号，即获得样品这个深度方向即具有相同频率的光谱所探测的样品的深度信息。