[发明专利]丝状真菌蛋白分泌压力反馈调控元件与抗反馈抑制的启动子、质粒及制备方法和转化细胞

权利要求书

1.丝状真菌蛋白分泌压力反馈调控元件，其特征在于，该调控元件为丝状真菌启动子-378bp～-291bp区域的碱基序列。

2.根据权利要求1所述丝状真菌蛋白分泌压力反馈调控元件，其特征在于，所述碱基序列，如SEQ ID NO.1所示。

3.抗反馈抑制的启动子，其特征在于，该启动子为丝状真菌启动子上至少缺失或者替换掉-378bp～-291bp区域的碱基所得的碱基序列、并且具有启动子活性。

4.根据权利要求3所述的启动子，其特征在于，所述丝状真菌启动子为amyB启动子。

5.根据权利要求3或4所述的启动子，其特征在于，该启动子为如SEQ ID NO.2所示的碱基序列。

6.一种质粒，其特征在于，将权利要求3或4或5所述的启动子连接到目标核酸序列上所构建的基因表达单元。

7.根据权利要求6所述的质粒，其特征在于，其DNA碱基序列如SEQ ID NO.8所示。

8.权利要求7所述的质粒的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：

以SEQ ID NO.3为模板，设计两对引物SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5，SEQ ID NO.6和SEQ ID NO.7，PCR扩增单独的两个片段；再使用引物SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.7，采用融合PCR方法将两个单独的片段融合成一个基因表达框，同时将该融合的大片段磷酸化；将pPTRⅠ质粒用SmalⅠ酶切并去磷酸化；将SmalⅠ酶切载体和融合片段，连接、转化得到质粒。

9.一种转化细胞，其特征在于，通过丝状真菌宿主细胞导入权利要求6或7所述的质粒而获得的。

10.权利要求9所述的转化细胞，其特征在于，所述宿主细胞为米曲霉（Aspergillus oryzae），黑曲霉（Aspergillus niger），泡盛曲霉（Aspergillus awamori）或构巢曲霉（Aspergillus nidulans）。