[发明专利]一种用于检测ALK基因表达的探针、引物及试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体地涉及一种ALK基因表达差异检测的探针、引物及试剂盒。

背景技术

受体型酪氨酸激酶间变性淋巴瘤激酶（Anaplastic lymphoma kinase，ALK）最早发现于间变性大细胞淋巴瘤（Anaplastic large cell lymphoma，ALCL）中，由2号及5号染色体易位所形成的融合蛋白质包含了ALK的3＇端胞内结构域，以及核磷蛋白（Nucleophosmin，NPM）的5＇端的结构域。随后的研究发现，正常的ALK专一表达于神经系统中，如脑和神经索，尤其是新生儿的脑中。ALK基因位于染色体2p23位点，正常情况下人源的ALK可转录产生大小6222bp的mRNA，由29个外显子构成，编码1620个氨基酸序列200KDa的I型跨膜蛋白ALK。该蛋白为一种受体酪氨酸激酶（receptortyrosinekinase，RTK），是RTK胰岛素超家族的成员。完整的ALK具有典型的RTK三部分结构，即胞外区、亲脂性跨膜区和胞内酪氨酸激酶。

据文献报道，ALK蛋白除在极少部分弥漫性大B细胞淋巴瘤中表达外，可在60%～85%的原发性系统性ALCL中表达，是原发性系统性ALCL相对特异的免疫表型特征。近年来研究人员亦发现ALK基因在肿瘤的发生和发展过程中发挥着重要作用。

ALK融合基因存在于约3％至7％的非小细胞肺癌（NSCLC）患者中。它是由2号染色体上的ALK基因位点发生断裂且与其他基因融合所致，多存在于非（轻度）吸烟肺癌患者中；文献资料显示，ALK融合断裂点绝大多数位于外显子20，ALK融合的发生导致了ALK断裂点两侧mRNA表达量的差异，ALK基因的外显子20-29之后的mRNA序列表达量明显增高，进而导致ALK基因的外显子20-29（3＇端）的表达量明显高于外显子1-18（5＇端）。

ALK激酶抑制剂的抗癌效果与ALK融合的存在与否密切相关。由辉瑞公司开发的crizotinib（商品名：Xalkori）是肝细胞生长因子受体Met蛋白、ALK以及它们的致癌变异体的小分子ATP竞争性抑制剂。体外研究证实，crizotinib是Met和ALK激酶抑制剂，能剂量依赖性地抑制Met基因发生扩增或ALK因发生易位或倒位的肿瘤细胞生长；临床研究表明：crizotinib对ALK阳性非小细胞肺癌(NSCLC)患者的生存情况有显著改善作用，且耐受性良好，安全性较高。已于2011年8月26日获美国FDA批准用于治疗局部晚期或转移性的、ALK为阳性的NSCLC。因此对NSCLC患者进行ALK融合基因的检测将帮助找到从crizotinib治疗中受益的患者，指导临床正确用药。

用于检测ALK融合基因的方法有多种，如免疫组织化学方法(IHC)、荧光原位杂交技术(FISH)和逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)等。早前的用于ALK融合基因检测的RT-PCR法，针对已报道的ALK融合类型进行设计并检测，检测谱只能涵盖已知的ALK融合类型，因此，不具有未知/未报道的ALK融合类型的检测能力，并且早前RT-PCR法采用电泳手段分析指示检测结果，难以避免扩增带来的假阳性；IHC法能够检测肿瘤特异性抗原表达，而不丢失能鉴别正常组织和病理组织的细胞和组织结构特征，具有快速筛选作用，但IHC法针对的是ALK蛋白表达量，可能存在假阳性情况（ALK蛋白表达量增高一方面可能由于肿瘤细胞中含有ALK基因融合，另一方面可能由于肿瘤细胞异常表达ALK蛋白），并且ALK蛋白表达结果可能会出现微弱的和局部的弱阳性结果，结果判读上存在一定主观性，对弱阳性结果须进一步用FISH等技术来验证。FISH技术可以运用探针诊断ALK重排，但该技术成本高、检测周期长，尤其是使用活检样本检测时，不易判读，并且对于特定融合类型，如EML4-ALK融合，因EML4基因与ALK基因在染色体位置上距离较近（12Mb），可能导致重排的分离信号不明显，产生假阴性结果。因此，临床上特别需要一种可以高效快速，高准确率，高灵敏度的定性基因表达的检测方法，从而为可为肿瘤患者个体用药提供科学依据，降低治疗风险以及患者负担。

针对上述问题，本发明开发一种快速、操作简便的ALK基因表达检测试剂盒及检测方法。本试剂盒以RNA为检测样本，通过检测5＇端和3＇端基因表达量的差异，提供ALK基因表达差异外显子的定性评估，适用于非小细胞肺癌患者在进入个性化靶向治疗之前。本检测方法灵敏度高，检测时间只需160分钟即可完成，同时具备了特异性好，准确率高，价廉快速，操作简单等优点，可以满足临床快速检测的实际需求。

发明内容