[发明专利]一种突变的聚半乳糖醛酸酶8fnA及其编码基因和应用

说明书

技术领域

本发明属于基因工程和蛋白质工程领域，具体涉及一种突变的聚半乳糖醛酸酶8fnA及其编码基因和应用。

背景技术

目前在NCBI注册的多聚半乳糖醛酸酶蛋白序列已达10760条，主要来源于植物（3485）、真菌（2604）和细菌（4179），其余来自其他物种。真菌多聚半乳糖醛酸酶主要来源于青霉属、曲霉属、根霉属、毛霉属、酵母属、克鲁维酵母属及毕赤酵母属等。与细菌及植物的多聚半乳糖醛酸酶基因进行系统进化分析，结果显示三种来源的多聚半乳糖醛酸酶明显的聚为三大类，很好的反映了它们的起源进化关系。真菌来源的多聚半乳糖醛酸酶处于完全独立的分支中，总体相似性介于11.3%～100%之间。内切聚半乳糖醛酸酶的最适pH介于3.5-5.5，最适温度介于30-50°C，已经报道的内切多聚半乳糖醛酸酶都是酸性。不同真菌来源的多聚半乳糖醛酸酶序列表现了很大的差异，但都含有4个保守性极强的结构域(175NTD、197DD、218GHG和250RIK)。其中结构域Ⅰ(NTD)和Ⅱ(DD)中的3个天冬酰氨(D)残基和结构域III(GHG)中的组氨酸(H)残基被认为与催化反应有关。目前有7个PG晶体结构报道，其中6个都来源于真菌Aspergillusniger,Fusariummoniliforme,Aspergillusaculeatus，Stereumpurpureum和Colletotrichumlupini，一个来源于细菌Erwiniacarotovora。来源于Aspergillusniger的endo-PG晶体解析显示了这类酶典型的三维结构：10个完整的转角组成一个右手螺旋，此螺旋含有4个平行的β折叠，一个小的α螺旋在N端覆盖了酶内部的疏水中心，无规卷曲loop在螺旋外部形成了一个口袋，口袋通道中的Asp(180),Asp(201)、Asp(202)与酶的催化活性相关，而His(223)、Arg(256)和Lys(258)则与底物结合有关。

果胶内切聚半乳糖醛酸酶在多个领域都有广泛的应用，当前应用最广的是在果蔬汁加工中。同样，内切聚半乳糖醛酸酶在饲料生产中也有很大的应用前景。饲料中的菜粕、豆粕、麸皮等原料都含有大量的果胶质，由于动物体内缺乏降解果胶的酶类，因而果胶被认为是动物饲料中的抗营养因子。已有实验证明将内切聚半乳糖醛酸酶添加到饲料中作用于果胶质能随机地从多聚半乳糖醛酸链内部消解α-1,4-糖苷键，产生聚合度为10～14的寡聚半乳糖醛酸，或从寡聚半乳糖醛酸链的非还原末端消除单个半乳糖醛酸，产生聚合度逐步降低的寡聚半乳糖醛酸链和半乳糖醛酸单体，从而降低食糜的粘度，提高营养物质的利用率。

目前国内饲料产业中果胶酶的应用还未得到推广，主要原因之一是缺乏性质优良适合饲用的酶种。与果蔬汁应用的酸性聚半乳糖醛酸酶不同，理想的饲用聚半乳糖醛酸酶应是高比活、pH中酸性。已有研究报道的大部分真菌来源聚半乳糖醛酸酶多为酸性，目前市场上性质优良的果胶酶产品多来自于国外酶制剂企业如诺维信等并且主要用于果蔬汁生产，饲用果胶酶产品则相对缺乏。因此研发pH中酸性具有高比活优良性质的饲用果胶酶将有力促进这一新兴酶种在饲料产业中的应用。

发明内容

本发明的目的是提供一种突变的聚半乳糖醛酸酶8fnA。

本发明的再一目的是提供编码上述突变的聚半乳糖醛酸酶8fnA的基因。

本发明的另一目的是提供包含上述基因的重组载体。

本发明的另一目的是提供包含上述基因的重组菌株。

本发明的另一目的是提供一种制备上述突变的聚半乳糖醛酸酶8fnA的基因工程方法。

本发明的另一目的提供上述突变的聚半乳糖醛酸酶8fnA的应用。

本发明对聚半乳糖醛酸酶8fnA（其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示）进行定点突变，精氨酸取代8fn113位点的氨基酸序列（即113位由Thr突变为Arg）。

因此突变后的聚半乳糖醛酸酶8fnA氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示：

MIPSVLILSLGALAAANPLPAKRASCTFTDAASAISGKKSCSTITLKDITVPAGTTLD

LTKLNDGTKVIFSGKTSFGYKEWAGPLISVSGNNIHVEGAPGHVIDGNGAKWWD

RKGSNGGKKKPKFFYAHSMKNSNIKGLNVKNTPVQAFSINGAENLGVYDVHLDN