[发明专利]空肠弯曲菌细胞致死性肿胀毒素表达载体的构建、表达及单克隆抗体的制备

说明书

技术领域

本发明涉及两种表达载体，特别是细胞致死性肿胀毒素cdtC基因的两种表达载体。本发明还涉及该表达载体的构建、表达及单克隆抗体的制备。

背景技术

空肠弯曲菌是一种重要的食源性人兽共患病原菌，是全球范围内引起人胃肠道感染最常见的病原菌。近年来，由空肠弯曲菌引起的人类疾病呈上升趋势，对其致病性研究已成为一个热点问题。

对其致病机理研究主要集中在外膜蛋白，结构蛋白和毒素，细胞致死性肿胀毒(Cytolethal distendin toxin,CDT)是由革兰阴性细菌产生的一种蛋白,它具有细胞毒性,能通过损伤DNA和激活细胞周期检查点将细胞周期阻断在G2/M期,导致细胞肿胀、死亡。细胞致死性肿胀毒素已被认为是空肠弯曲杆菌感染的重要的发病因素。

空肠弯曲杆菌的细胞致死性肿胀毒素由三种染色体排列的相关基因cdtA、cdtB、cdtC的操纵子编码成的多肽CdtA、CdtB和CdtC构成。CdtB是细胞致死性肿胀毒素的关键成分,是该毒素的活性亚单位。CdtA负责绑定在细胞表面，CdtC帮助CdtB表现出毒素活性。空肠弯曲菌的CdtC是必需的或至少能增强细胞毒活性，这种亚基可能会从诱导人类上皮INT407细胞系在体外释放白细胞介素（IL）-8，CdtC特异性抗体可以抑制毒性。该种毒素是一种外毒素，直接从细菌的培养上清中直接提取该种蛋白比较困难。

发明内容

本发明的目的在于提供两种重组质粒载体，该载体均含有cdtC基因。

本发明的另一目的在于上述载体蛋白在制备抗cdtC的单克隆抗体的应用。

本发明构建含cdtC基因的原核表达质粒，在大肠杆菌中表达组氨酸（Histidine，His）-CdtC融合蛋白谷胱甘肽巯基转移酶（Glutathione S-transferase，GST)-CdtC融合蛋白。为排除标签的影响，以GST-CdtC为免疫原，His-CdtC为检测原。为制备CdtC的单克隆抗体奠定基础。

抗CdtC单克隆抗体的制备方法按以下步骤实现：一、His-CdtC、GST-CdtC蛋白的原核表达并纯化；二、以GST-CdtC免疫BABL/c小鼠，取效价比较高的小鼠的脾细胞与SP2/0细胞融合，培养并筛选出分泌特异性抗体的细胞株；三、将筛选的细胞株注入BABL/c小鼠腹腔，获得高浓度的单克隆抗体，即完成单克隆抗体的制备；四、对单克隆抗体的上清，腹水效价测定，亚类测定及特异性实验。

其中步骤一采用pET-30a，pGEX-6p-1原核表达载体，2种载体含有不同的标签，pET-30a载体含有His标签，pGEX-6p-1含有GST标签。重组质粒DNA测定结果证实了含有目的基因。将重组菌BL21(DE3)(pET-cdtC)和BL21(pGEX-6p-1-cdtC)分别接种于含有卡那和氨苄抗生素的培养基中培养，IPTG诱导表达。离心收集菌体，SDS-PAGE分析。当基因表达时表达产物为His和目的基因表达蛋白的融合体，GST和目的基因表达蛋白的融合体。2种融合蛋白的的大小为36KD，47KD。

步骤二选取6-8周龄的雌性BALB/c小鼠。首次免疫：将第一章获得GST-CdtC蛋白（100ug/只）与等体积的弗氏完全佐剂混合，并充分乳化，皮下多点免疫。再次免疫：首次免疫2周后，GST-CdtC蛋白（100ug/只）与等体积的弗氏不完全佐剂混合，经充分乳化后皮下注射。7d后眼眶采血测定效价。在融合前三天，尾静脉注射纯化的GST-CdtC蛋白。

步骤三对9-11周龄的雌性BALB/c小鼠腹腔注射液体石蜡（0.3-0.5ml/只），7-10d后，将处于对数生长期的杂交瘤细胞用PBS悬浮（5×10⁵个/0.3mL），腹腔注射。7天左右待小鼠腹部明显膨大，采集腹水，离心收集上清，-70℃保存。

步骤四利用ELISA方法测定上清和腹水效价，按单克隆抗体亚类试剂盒鉴定抗体亚类，Western-blot试验鉴定单抗的特异性。

附图说明

图1是cdtC基因PCR扩增图；M:DL2000；2:Amplification of cdtC gene。

图2是重组质粒pMD-18-T-cdtC酶切鉴定图谱；M:DL2000，1:pMD-18T-cdtC/BamH I+Xho I。

图3是重组质粒pET-cdtC、pGEX-6p-1-cdtC的酶切图；1:pET-32a-cdtC/BamH I+Xho I；2:pGEX-6p-1-cdtC/BamH I+Xho I。