[发明专利]一种组胺半抗原、人工抗原、抗体及其制备方法与应用

说明书

技术领域

本发明属于食品安全免疫检测技术领域，更具体地，涉及一种组胺半抗原、人工抗原、抗体及其制备方法与应用。 

背景技术

生物胺是一类含氮的低分子有机碱，主要由氨基酸脱羧作用形成，广泛存在于富含氨基酸、蛋白质的肉制品、水产品和发酵制品等。适量的生物胺是维持人体正常生理功能所必需的，过量则会引起过敏反应，严重的还会危及生命。此外，食品中生物胺含量与食品品质有一定的相关性。因此，加强食品中生物胺的监测对提高食品品质和安全性具有重要意义。生物胺中对人体健康影响最大的是组胺。摄入8~40 mg组胺会产生轻微的中毒症状，超过40 mg产生中等中毒症状，超过100 mg产生严重中毒症状。美国FDA通过对爆发组胺中毒的大量数据的研究，确定组胺的危害作用水平为500 mg/kg(食品)。生物胺中毒事件时有发生且多于组胺有关，近年来，我国在广东、浙江、山东等多地都爆发过组胺中毒事件，据报道，仅杭州下城区，在1997年至2006年的十年间就发生7次组胺中毒事件。由于生物胺中毒都一般都与组胺有关，欧美及我国对部分食品中组胺含量做了限量要求。美国FDA要求进口水产品组胺不得超过50 mg/kg；欧盟规定鲭科鱼类中组胺含量不得超过100 mg/kg；我国规定鲐鱼中组胺不得超过1000 mg/kg；其他海水鱼不得超过300 mg/kg。 

目前国内外检测组胺的常用方法主要集中在仪器方法如高效液相色谱-质谱联用、毛细管电泳等方法，这些方法样品预处理要求高、步骤复杂、操作需专业人员、检测费用高、所依赖仪器昂贵复杂、费时费力，很难适应许多场合快速检测的需要，在应用上不能广泛推广。 

基于抗原-抗体特异性结合的免疫分析法具有样品前处理简便、操作简单、快速、灵敏、高通量等特点，被誉为是21世纪最具竞争和挑战的快速检测技术，在食品安全领域具有广阔的应用前景。但是，对于免疫分析法而言，抗体作为核心原材料是决定整个方法性能的重要基础，而抗体的效果很大程度上取决于引起相应动物发生免疫反应的抗原结构。由于组胺分子质量非常小（111.14 Da），得到高特异性针对其的抗体一直是有关学者致力解决的难题。 

1984年，Mital等人在《Agents and Actions》发表题为An attempt to produce an antibody of histamine and histamine derivatives的文章，他们首先尝试了用牛血清蛋白（BSA）-丁二酰组胺偶联物作为免疫原去免疫大白兔，得到的血清含有抗BSA的抗体，没检测到识别半抗原（组胺）的抗体；接着，他们又将BSA与对-[2-(N-三氟乙酰组胺)偶氮基]苯甲酸偶联免疫兔子，得到了对三氟乙酰组胺有一定识别的抗体，然而该抗体对含三氟乙酰基的化合物都有一定的识别，不适合用于建立免疫分析方法。1986年，Guesdon等人在《Journal of Immunological Methods》发表题为Monoclonal anti-histamine antibody: preparation,characterization and application to enzyme immunoassay of histamine的文章，他们选择通过对苯醌将组胺与BSA偶联免疫Balb/c小鼠得到一株分泌针对组胺与苯醌复合物的单克隆抗体的杂交瘤细胞；该抗体对组胺苯醌复合物的亲和力达到约1.3×10⁹ L/mol。但是，采用对苯醌与组胺衍生化副反应很多，反应过程不好控制，且产物稳定性不好，导致重复性差。1988年，Morel等人在《Journal of Allergy and Clinical Immunology》发表题为“Immunoanalysis of histamine through a novel chemical derivatization”的文章，他们用琥珀酰甘氨酰亚胺作衍生试剂，衍生组胺，并制备了针对该衍生物的单克隆抗体，该抗体与衍生物的亲和力比组胺本身高5×10⁵倍，并与其他类似物不存在交叉反应，但是该衍生方法的步骤多，操作复杂，产物纯化难度很大。因此，可以看出：目前检测组胺的免疫检测方法都是通过测定组胺的衍生物来实现的，衍生剂主要选择对苯醌或琥珀酰甘氨酰亚胺，选择这两种衍生剂的主要问题在于衍生效率较低、副反应多、反应步骤多、产物难以纯化等，因此对于准确、快速检测食品中的组胺十分不利，急需解决其衍生剂的选择等问题。 

发明内容