[发明专利]抗氧化肽及其制备方法

权利要求书

1.抗氧化肽的制备方法，其特征在于该方法步骤如下：

（1）青养蛋白酶解物的制备：将青养肉与水按质量比1:1～1:4混合，加入加入Papain或Flavourzyme中的一种或两种，在50～55 ℃酶解4～20 h；85～95 ℃下灭酶15～30 min，离心，取上清液，得到青养蛋白酶解液；

（2）抗氧化肽的分离纯化：将青养蛋白酶解液分别通过截留分子量为5000 Da和1000 Da的超滤膜，滤去大分子，取透过液，冷冻干燥成粉末；用Amberlite IRC50 阳离子交换柱 (? 3.6×60 cm)进行分离，分别用pH值为5、10、12的50mM乙酸铵缓冲液进行洗脱，洗脱速度为2-7 mL/min，检测波长为214 nm；再用Sephadex G-15凝胶柱(?1.6×100 cm)进行分离纯化，用去离子水以0.5～2 ml/min的流速进行洗脱，检测波长为214nm，测定各洗脱峰对应组分的抗氧化活性，收集活性最高的两个组分，然后冷冻干燥得活性最高的粉末B2和活性次高的粉末B3；

（3）将粉末B2和粉末B3分别溶于水后，再分别用反相高效液相色谱进一步纯化，分别得到活性组分B2-c和活性组分B3-a，其中纯化条件为：色谱柱为XBridge^TM pre C₁₈ 柱(5 μm, 10 × 150 mm; Waters, USA)，流动相为A相（已腈）-B相（0.1%三氟乙酸V/V），洗脱程序为：在0-4min内采用的流动相中A、B的体积百分比分别为5%和95%；在4-8min内采用的流动相中A、B的体积百分比分别为10%和90%；在8-12min内采用的流动相中A、B的体积百分比分别为20%和80%，在12-30min内采用的流动相中A、B的体积百分比分别为50%和50%，流速为1.5-4ml/min，检测波长为215nm，测定各洗脱峰对应组分的抗氧化活性，收集活性最高的峰；

（4）将收集到的活性组分B2-c和活性组分B3-a分别用高效液相再一次纯化，得到活性组分B2-c-2和活性组分B3-a-2，再进行冷冻干燥，得到目标肽；所述纯化的条件为：色谱柱为XBridge^TM C₁₈柱（5 μm, 4.6 × 150 mm; Waters, USA）, 流动相为A相（已腈）-B相（0.1%三氟乙酸V/V），洗脱程序为：在0-4min内采用的流动相中A、B的体积百分比分别为5%和95%；在4-8min内采用的流动相中A、B的体积百分比分别为10%和90%；在8-12min内采用的流动相中A、B的体积百分比分别为15%和85%，在12-30min内采用的流动相中A、B的体积百分比分别为30%和70%，流速为0.6-1ml/min，检测波长为215nm。

2.以权利要求1所述方法得到的抗氧化肽，其特征在于，所述活性组分B2-c-2具有Leu-Lys的氨基酸序列，所述活性组分B3-a-2具有Phe-Lys的氨基酸序列。