[发明专利]Apidaecin型抗菌肽在毕赤酵母菌中的表达及扩大培养

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及Apidaecin型抗菌肽在毕赤酵母菌中的表达及扩大培养。

背景技术

国家中长期科技发展纲要重点中，将人类健康与疾病的生物学基础列为国家重大战略需求的基础研究。自从发现抗生素以后人类的健康事业得到了巨大的发展，然而随着滥用抗生素导致了大量耐药菌的出现。所有的常规抗生素都出现了相应的抗药性致病株系，致病菌的抗药性问题已经日益严重地威胁着人们的健康。寻找全新类型的抗生素是解决抗药性问题的一条有效途径。

抗菌肽又叫抗微生物肽、抗生素肽，是生物界中广泛存在的一类生物活性小肽。这类生物活性小肽是非专一性的免疫应答产物，具有广谱抗菌作用。它不仅能抗多种细菌或真菌，而且还抗原虫、病毒或肿瘤细胞。对革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌、真菌均有抑杀作用，最重要的是可以杀伤动物体内的肿瘤细胞，却又不破坏动物体内的正常细胞[1]。迄今，已在许多生物包括动物（昆虫、鸟类等）、植物及原核生物中发现600多种内源性抗菌活性肽，其中许多抗菌肽的cDNA已被克隆测序，并对某些抗菌肽基因进行了初步的基因定位和表达调控的研究[2]。近几年来，有关抗菌肽及其应用已逐渐成为生物学、医学、农业科学、生理学等领域研究的热点，在医药卫生、农业生产、食品工业等都有广泛的应用及前景。

Apidaecin型抗菌肽指由昆虫细胞诱导表达的一类小的、富含脯氨酸 (Pro) 的、长度为18-20个氨基酸的抗菌肽。结构分析表明，Apidaecin含有两个活性区域，即决定抗菌肽抗菌活性的保守区和决定抗菌肽抗菌谱的可变区。Apidaecin为由基因编码的没有经过翻译后修饰的抗菌肽，其主要对一些革兰氏阴性菌具有抑菌活性。Apidaecin发挥抑菌活性的机制包括以下几步：首先Apidaecin非特异性地结合于细菌细胞外膜的脂多糖 (LPS) ，随后进入细胞内外膜之间的外周胞质，并通过一种特异性的方式不可逆地与细胞内膜的受体/停靠蛋白（可能是定位于细胞内膜上的一种酶型转运系统）结合；最终，抗菌肽进入细胞内部并与其最终的靶蛋白相互作用。Apidaecin独特的作用机制使其成为有潜力的传统抗生素的替代品。

以往提取Apidaecin型抗菌肽的方法总共有两种：一是直接从蜜蜂体内通过化学的方法提取，这种方法将会引入很多毒性的化学试剂，并且产量非常的低，这种方法经常会用在科学研究中，而不适合大规模生产，还有一种方法是利用已经比较成熟的链霉菌、大肠杆菌和乳酸乳球菌等原核细菌表达系统去表达，但是，Apidaecin型抗菌肽对原核细胞具有杀灭的作用，这种现象导致其发酵过程很难顺利完成，产量也比较低，所以，这种方法也很难实现大规模的生产。

发明内容

本发明提供了Apidaecin型抗菌肽在毕赤酵母菌中的表达方法，利用该方法可以实现Apidaecin型抗菌肽的规模化生产。

毕赤酵母是一种可高效表达外源蛋白的表达系统，具有遗传稳定性。毕赤酵母的醇氧化酶(AOX)基因的启动子具有强诱导性和强启动性，适于外源基因的高水平诱导表达，可高密度发酵等许多优点，应用十分广泛，已有数百种外源蛋白在该系统中获得表达。关于Apidaecin型抗菌肽在毕赤酵母中的表达，未见报道。

本发明提供了Apidaecin型抗菌肽在毕赤酵母菌中的表达方法，步骤如下：

（1）、Apidaecin型抗菌肽的修饰；

（2）、构建表达载体；

（3）、酶切重组质粒，电击转化毕赤酵母感受态细胞；

（4）、Apidaecin型抗菌肽的表达。

进一步地，步骤（1）中所述修饰是在5’端加入Kex2信号肽酶的切割识别位点，整个基因前后分别加入XhoI和Not I位点。

    进一步地，步骤（3）中所述电击转化的条件为：电压为：1.5kv,电击4ms，电击一律在冰上进行；电击完毕后，放置于0℃预冷过的质量浓度为60%的山梨醇溶液中。

进一步地，步骤（4）中Apidaecin型抗菌肽的表达是先用BMGY培养基进行培养，离心将菌体重悬后，再在摇床上继续培养。

    进一步地，所述BMGY培养基的配比为：质量百分数为2％的蛋白胨，1％的酵母提取物，100mmol/L的磷酸钾缓冲液，1.34％的酵母氮碱基，0.4μg/mL的维生素H，1％的甘油，其余为ddH₂O；其中，100mmol/L磷酸钾缓冲液在加入培养基前调pH至6.0；