[发明专利]基因重组毕赤氏酵母高表达发酵生产舍雷肽酶的方法

说明书

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，涉及一种基因重组毕赤氏酵母高表达发酵生产舍雷肽酶的方法。

背景技术

舍雷肽酶属于蛋白分解酶，具有很强的溶解纤维蛋白块、消除黏性脓痰和净化炎症病灶面等作用，临床广泛用于呼吸道疾病引起的排痰困难。舍雷肽酶具有化痰、减轻炎症反应、消除水肿或肿胀的租用：其机制是通过降解异常渗出物、变性蛋白质及纤维素凝块，使脓、痰、血凝块等液化变稀，易于引流排出；促进血管、淋巴管对分解产物的吸收，从而改善炎症病灶的循环，消除脓胀，促使肉芽组织新生，从而达到标本兼治之效果；减少缓激肽、肿瘤坏死因子（TNF）等炎症介质的释放；并与抗生素有协同作用。本品对纤维蛋白、凝血因子I有很强的溶解能力。

发明内容

本发明的目的是提供一种基因重组毕赤氏酵母高表达发酵生产舍雷肽酶的方法，采用了巴斯德毕赤氏酵母（Pichia pastoris）生产舍雷肽酶，本方法使用了来源于沙雷氏菌的舍雷肽酶的基因，使用不同的培养方法和提取发酵方法。通过基因克隆技术，巴斯德毕赤氏酵母（Pichia pastoris）中导入了舍雷肽酶基因，使巴斯德毕赤氏酵母大量产生舍雷肽酶，基因构建后的重组舍雷肽酶质粒具有甲醇诱导和高效表达的特征，可以实现高密度的高表达，实现工业化生产舍雷肽酶。

为了解决上述技术问题，本发明通过下述技术方案得以解决：

基因重组毕赤氏酵母高表达发酵生产舍雷肽酶的方法，采用了巴斯德毕赤氏酵母（Pichia pastoris）生产舍雷肽酶，从沙雷氏菌（SerratiaBizio）中克隆出舍雷肽酶的基因，SER基因通过基因筛选技术，构建成PPIC9K-SER重组质粒，PPIC9K-SER重组质粒转化到毕赤氏酵母GS115Z中表达，然后筛选出高效表达转化子，经甲醇诱导产生重组酶，制得舍雷肽酶。

作为优选，筛选出高效表达转化子时，挑阳性克隆单菌落接种于BMGY培养基上摇床培养，离心收集菌体，用BMMY培养基重悬，至OD₆₀₀≈1，再次挑阳性克隆单菌落接种于BMGY培养基上摇床培养，离心收集菌体，用BMMY培养基重悬，至OD₆₀₀≈1继续摇床培养。

作为优选，BMGY培养基中含有少量酵母粉、甘油和生物素，按质量分数计为酵母粉2-5%、甘油10-20%、生物素1-2%。

作为优选，摇床培养的条件为28℃-32C，250-350r/min培养至OD₆₀₀=2～6。

作为优选，经甲醇诱导产生重组酶时，每24h向培养基中添加无水甲醇至终浓度为1%，培养48h，检查容氧率为18-23%之间，离心收集上清液，通过膜浓缩，经冷冻真空干燥制成粉状的舍雷肽酶。

作为优选，用于浓缩的膜的分子量为30000。

本发明提供了一种基因重组毕赤氏酵母高表达发酵生产舍雷肽酶的方法，采用了巴斯德毕赤氏酵母（Pichia pastoris）生产舍雷肽酶，本方法使用了来源于沙雷氏菌的舍雷肽酶的基因，使用不同的培养方法和提取发酵方法。通过基因克隆技术，巴斯德毕赤氏酵母（Pichia pastoris）中导入了舍雷肽酶基因，使巴斯德毕赤氏酵母大量产生舍雷肽酶，基因构建后的重组舍雷肽酶质粒具有甲醇诱导和高效表达的特征，可以实现高密度的高表达，实现工业化生产舍雷肽酶。在生物医药技术领域具有良好的应用前景。

附图说明

图1为添加甲醇诱导后舍雷肽酶发酵活性的示意图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步详细描述。

实施例

基因重组毕赤氏酵母高表达发酵生产舍雷肽酶的方法，采用了巴斯德毕赤氏酵母（Pichia pastoris）生产舍雷肽酶，从沙雷氏菌（SerratiaBizio）中克隆出舍雷肽酶的基因，SER基因通过基因筛选技术，构建成PPIC9K-SER重组质粒，PPIC9K-SER重组质粒转化到毕赤氏酵母GS115Z中表达，然后筛选出高效表达转化子，经甲醇诱导产生重组酶，制得舍雷肽酶。

筛选出高效表达转化子时，挑阳性克隆单菌落接种于BMGY培养基上摇床培养，离心收集菌体，用BMMY培养基重悬，至OD₆₀₀≈1，再次挑阳性克隆单菌落接种于BMGY培养基上摇床培养，离心收集菌体，用BMMY培养基重悬，至OD₆₀₀≈1继续摇床培养。

BMGY培养基中含有少量酵母粉、甘油和生物素，按质量分数计为酵母粉2-5%、甘油10-20%、生物素1-2%。