[发明专利]检测microRNA-122的试剂盒及方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物领域，尤其涉及检测microRNA-122的试剂盒及方法。

背景技术

microRNAs是在多种真核细胞及病毒中发现的一类来源内源性染色体上的非编码单链小分子RNA，其长度为21～25nt，在进化上具有高度的保守性，能够通过与其目标mRNA分子的3′端非编码区域(3′unt ranslated region,3′UTR)互补导致该mRNA分子的翻译受到抑制。miRNA参与调控真核生物超过1/3以上基因的表达、抑制靶基因的翻译、引起mRNA的降解等，具有非常重要的生物学功能。进一步研究表明，miRNAs在细胞增殖、分化和凋亡、神经元的极性、胰岛素分泌、大脑形态形成、心脏形成、胚胎发育，生物个体死亡等过程中发挥着关键性的作用，这些最新的研究发现为我们提供了全新的疾病发生、发展调控网络，拓展了我们对疾病发生机制的理解和认识。

miRNAs可存在于人体的多种体液中，具有严格的时空性和组织特异性。循环miRNAs是正常细胞或肿瘤细胞释放到血清/血浆的miRNAs，与目前临床常用的蛋白质类、激素类标志物相比，可更早预测和发现疾病发生发展状态。循坏miRNAs是基因表达水平的新型疾病相关特异性生物标志物，在临床实验诊断领域具有巨大的潜能和优势，无疑将极大地提高重大疾病的诊断和治疗水平。

快速、准确、灵敏的miRNAs检测技术是确保循坏miRNAs生物标志物成功应用于临床的关键环节。目前，检测miRNAs的方法主要有Northern印迹分析、基因芯片和实时定量PCR等，但是，由于上述方法都需要预先对样本进行反转录和PCR扩增，才能完成检测，这样既大为增加了检测复杂性和检测时间，又一定程度上干扰了miRNAs的定量检测，同时预扩增存在的实验室污染问题也极大地影响了这些检测方法的准确性，使得这些方法的临床实际应用受到了极大的限制。因此，针对上述问题，如能开发出一种基于新型探针技术，可避免反转录扩增和PCR扩增，直接对多种miRNAs进行并行定量检测的快速、特异、简便的miRNAs检测方法，对于miRNAs的基础研究和临床实际检测，显然都具有十分重要的意义。

microRNA-122（miR-122）在肝脏中高度表达，在其它器官组织中的表达很低甚至检测不到，其表达量占了肝脏中所有miRNA的70%以上，miR-122位于18号染色体上，定位于18q21.31。大量研究表明，miR-122在肝细胞生长、应激反应、脂质代谢、病毒感染、细胞增殖、基因表达、肝细胞表型维持以及肝细胞肝癌等多种生物学过程方面起调控作用，是肝脏重要的调控因子之一。目前，还没有一种快速、特异、简便的检测miR-122的试剂盒及方法。

发明内容

本发明的目的是提供一种检测miR-122的试剂盒。

一种试剂盒，包括如下结构的两条探针，

所述非对称发夹探针1，包括回文序列C、两条茎臂B和b、以及连接于茎臂B上的粘性末端A，所述两条茎臂B和b连接于回文序列C的两端且具有互补的核酸序列，所述回文序列C为无关序列，所述茎臂B与其连接的粘性末端A具有靶序列的互补核酸序列；

所述非对称发夹探针2，包括回文序列a、两条茎臂B和b、和连接于茎臂B上的粘性末端c，所述两条茎臂B和b连接于回文序列a的两端且具有互补的核酸序列，所述回文序列a与其相连的一条茎臂b具有靶序列，粘性末端c具有和非对称发夹探针1中所述的无关序列C互补的核酸序列；

所述microRNA-122的靶序列为：

ACUGGAGUGUGACAAUGGUGUUUG。

优选：所述非对称发夹探针1的核苷酸序列为：CAAACA CCATTGTCACACTCCAGT CAAAGT ACTGGAGTGTGACAATGG

所述非对称发夹探针2的核苷酸序列为：ACTGGAGTGTGACAATGG TGTTTG CCATTGTCACACTCCAGT ACTTTG。

一种杂交链反应体系，包括上述非对称发夹探针1和非对称发夹探针2。

所述反应体系还包括待测microRNA-122的靶序列。

本发明还提供一种检测microRNA-122方法。

一种检测microRNA-122方法，包括以下步骤：

（1）将上述非对称发夹探针1和非对称发夹探针2以及待测microRNA-122加入到杂交链反应体系中进行反应，得到反应产物；

（2）对所述步骤（1）得到的反应产物进行电泳检测；

其反应时的条件为99℃，8分钟；50℃，1小时。