[发明专利]一种合成短单链脱氧核糖核苷酸探针的方法

说明书

技术领域

本发明属于DNA生物合成领域，具体涉及一种合成短单链脱氧核糖核苷酸（short single strand DNA，sssDNA）探针的方法，可用于检测小的非编码核糖核酸（small non-coding RNAs），如微核糖核酸（microRNA）。

背景技术

短单链脱氧核糖核苷酸（sssDNA）可作为探针用于科研和医学诊断。最近十几年关于小非编码RNA的研究非常火热，尤其是微RNA，科学家和医药公司对以微RNA作为靶点来研发诊断试剂盒和药物的前景也非常看好。由于微RNA通常只有18-30个碱基(Bartel,2004)，而且一个家族的微RNA差异可能只有1-2个碱基(www.mirbase.com)，因此用杂交方法来检测微RNA的话，对探针的纯度要求高。如果探针有碱基突变的话，会导致检测结果为假阴性或假阳性。

现有合成短核苷酸技术主要是通过固相化学合成(Reese,2005)，这个方法虽然广泛应用于生产寡核苷酸，但其有一定的错误率，且错误率随合成的核苷酸的长度增加而增加。这种方法是从核酸的3’向5’端逐渐加上单个的碱基，因为每加上一个碱基时效率都达不到100%，现在通常的效率是99%左右，所以用这种方法合成的含21个碱基的脱氧核糖核苷酸通常只有79%左右的纯度(Lohmann et al.,2007;Pon et al.,1996)。虽然合成后的纯化（常用HPLC或PAGE纯化）能帮助富集预期目的大小的脱氧核糖核苷酸，但无法减少拥有同样大小的突变的脱氧核糖核苷酸杂质。因而现有的固相化学合成的寡核苷酸产品经纯化后也不可能达到100%纯度。这对那些需求100%纯度（序列一致）的寡核苷酸的应用是个致命缺点。

科研者也在寻求以生物酶合成方法生产高纯度的短单链脱氧核糖核苷酸的方法。PCR（polymerase chain reaction，聚合酶链式反应）被用于生产长度为30个碱基的短核苷酸探针(Bertilsson et al.,2002,Appl Environ Microbiol)，但这种方法存在两个缺点：一是PCR需要以化学合成的引物来扩增，而合成的引物总会有突变的，这就使PCR的产物中携带了引物中的突变，导致产物达不到100%的纯度，而且对扩增的产物长度有限制；另一个缺点是PCR合成的产物是双链，需要额外的步骤来把双链分离并纯化出目的单链。

2003年Van Ness J等描述了一种恒温扩增单链寡核苷酸片段的方法(Van Ness et al.,2003)。具体是利用一种热稳定的切口内切酶N.BstNBI在双链寡核苷酸片段打上切口，这样有切口的一条寡核苷酸片段就会从双链模板上脱落，产生一个5’突出的末端，随后DNA聚合酶就可以补齐这个末端产生新的双链寡核苷酸，新合成的双链寡核苷酸又可以被切口内切酶Nt.BstNBI打上切口，聚合酶又可以进行复制，这样就达到了扩增小片段核苷酸的目的。这种方法有很大的局限性:恒温扩增对扩增的寡核苷酸的长度有严格的要求,如果要扩增的寡核苷酸太长，Tm值就会太高，切口内切酶作用于双链寡核苷酸片段后产生的寡核苷酸片段就不会从模板上脱落；相反，如果要扩增的寡核苷酸太短，Tm值就会太低，寡核苷酸片段就很容易从模板上脱落。因此，这种方法只适合扩增8-16个碱基的寡核苷酸，对于更短或更长的寡核苷酸扩增就无能为力了。

也有报道用滚环扩增的方法生产核苷酸（李岩等，2011,一种高效扩增小片段DNA方法的建立；Lohmann et al.,2007)。Lohmann等2007年报道用滚环扩增的方法生产66个碱基的核苷酸。最近李岩等报道用滚环扩增的方法生产更短核苷酸，他们是先把化学合成的单链寡核苷酸链接成环，用这个环状寡核苷酸作为模板，利用phi29DNA聚合酶以单向或双向短引物开始复制，其产物分别是一条很长的单链DNA（单向引物）或者是一条很长的双链DNA（双向引物）。这个方法的缺点:一是把化学合成的模版和引物的中的错误带至产物中了；二是没找到把长单链切割成特异短链的方法；三是长双链DNA虽然可以被内切酶切割，但要求被复制扩增的目的DNA片段含有酶切位点，即不能扩增特定的不含内切酶的序列，并且切割后的产物还是双链，不能用于需要单链探针的实验和诊断。