[发明专利]一种猪视网膜细胞及其应用

说明书

技术领域

本发明属于细胞培养领域，具体涉及一种猪视网膜传代细胞及其应用。

背景技术

猪圆环病毒病(Porcine Circovirus Disease，PCVD)是由PCV2病毒感染而引起的一种临床症状为渐进性消瘦、呼吸困难急促、贫血、腹泻、黄疸、间质性肺炎、淋巴结炎及肾炎，主要侵害5～12周龄断奶仔猪，与近年来发生的 PMWS、猪皮炎与肾炎综合征（Porcine Dermatitis and Nephropathy Syndrome, PDNS）、猪呼吸道综合征(Porcine Respiratory Disease Complex, PRDC)、A2型先天性振颤(Congenital Tremor, CT)、猪增生性和坏死性肺炎(Porcine Proliferative and Necrotizing Pneumonia, PNP)、繁殖障碍等疾病都有密切相关。PCV2的危害在于能够使感染猪只的免疫功能受到损害，导致机体抵抗力下降，并经常以亚临床感染的形式出现，易被忽视。由于PCV2感染使免疫系统受到损害，容易继发或并发其它病原体，使病情加重，并造成更大危害。本病呈世界性流行，自2000年证实我国存在此病以来，现已在我国猪群中普遍存在，给我国养猪业造成相当大的经济损失。

研究发现，猪圆环病毒2型（以下简称PCV2）能在单核细胞、肝细胞、心肌细胞以及肾上皮细胞等原代细胞中繁殖，也能在Vero等传代上皮细胞中繁殖，但观察不到细胞病变，只有在猪视网膜上皮细胞内繁殖能使细胞产生明显的病变。而原代猪视网膜上皮细胞有分裂次数限制，体外培养20几代以后细胞就会自然衰老死亡。因此需要构建一株能连续传代的猪视网膜上皮细胞，以供PCV2的分离、培养、鉴定。

发明内容

本发明的目的是提供一种猪视网膜上皮细胞，以供PCV2病毒的分离和鉴定，从而弥补现有技术的不足。

本发明将含有LTAg基因的质粒转入到原代猪视网膜上皮细胞中建立了传代猪视网膜细胞MPR，该细胞可以连续传代培养，培养至80代时细胞形态和性状均未发生改变。PCV2病毒可以在该细胞内大量增殖，并引起明显的细胞病变。

本发明的一个方面涉及一个转基因传代猪视网膜上皮细胞MPR，其保藏编号为：CCTCC NO: C2012193，保藏单位：中国典型培养物保藏中心。保藏单位地址: 湖北省武汉市武汉大学，保藏日期：2012年12月13日。

本发明的细胞的构建，是将表达SV40病毒大T抗原LTAg基因和新霉素抗性（neomycin resistance）基因的质粒转入猪视网膜上皮细胞中构建的。

所述的质粒为质粒pcDNA3.1-LTAg，其启动子为CMV（人巨细胞病毒）。

本发明猪视网膜上皮细胞MPR的应用，用于PCV2病毒的分离、培养以及鉴定。

本发明的MPR细胞与原代猪视网膜上皮细胞形态无变化，能连续稳定传代至80代以上。经western blot和RT-PCR检测，MPR细胞能持续稳定表达LTAg，第80代细胞仍能检测出LATg的稳定表达。因此，本发明的MPR细胞在PCV2病毒的分离、培养以及鉴定中具有很好的应用前景。

具体实施方式

本发明将1个LTAg表达质粒稳定转染到猪视网膜上皮细胞中,经过长期的筛选获得了能够稳定遗传的传代细胞，并建立了PCV2病毒的培养方法。

转入猪视网膜上皮细胞中的pcDNA3.1-LTAg质粒是由pcDNA3.1(+)质粒构建的，在质粒中插入LTAg基因，该基因的表达由CMV（人巨细胞病毒）启动子驱动。pcDNA3.1(+)质粒中还含有Neomycin（新霉素）抗性基因，因此可以用药物G418来筛选能稳定表达LTAg的细胞。经G418压力筛选得到能稳定表达LATg，并能连续传代、性状稳定的猪视网膜上皮细胞MPR。MPR细胞接PCV2病毒72小时能观察到明显的细胞病变，并且病毒滴度能达到6.5。

实施例1   LTAg表达质粒pcDNA3.1-LTAg的构建