[发明专利]大量生产γ-聚谷氨酸的诱变菌株枯草芽孢杆菌及其培养方法

说明书

技术领域

本发明属于发酵工程技术领域，具体涉及一种大量生产γ-聚谷氨酸的诱变菌株枯草芽孢杆菌及其培养方法。

背景技术

γ-聚谷氨酸[γ-poly(glutamic acid),γ-PGA]，是由L-谷氨酸[L-Glu]、D-谷氨酸[D-Glu]单体通过γ-谷氨酰胺键结合而成的一类均聚氨基酸。近年来对这种高分子材料的研究开发进展迅速，该种材料可以自然降解，而且降解产物无毒害，不会对环境产生二次污染。γ-PGA作为一种高分子聚合物，具有许多独特的物理、化学和生物学特性，例如可生物降解性、强吸水性、良好的生物相容性、可塑性、粘结性等特性。这些特性使其具有增稠、乳化、凝胶、成膜、保温、缓释、助溶和黏结等有益功能。因此，在注重环保，强调可持续发展的今天，γ-PGA及其衍生物在农业、环保、医药、水处理及化妆品工业等领域有着广泛应用前景。

γ-PGA是迄今发现的少数几个可以利用生物聚合得到的聚合氨基酸之一。1937年Ivaovics等在病原菌炭疽芽孢杆菌（Bacillus anthracis）的荚膜中首次发现了γ-PGA，此后在一些非致病性的芽孢杆菌属（Bacillus sp.）革兰氏阳性菌的荚膜中也发现了γ-PGA的存在，例如地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）。γ-PGA作为某些微生物荚膜的主要成分之一，很多环境下是作为微生物的一种适应性因子存在，如保护细胞不受蛋白酶的攻击或高盐环境下保持水分的吸收。γ-PGA对环境无污染，为绿色生物产品。目前日本、我国台湾和美国等对γ-PGA发酵的研究处于世界领先水平，很多相关的生产工艺和技术已经形成专利。其中我国台湾味丹企业已经实现了γ-PGA的商业化生产。

目前合成γ-PGA的主要方法是微生物发酵法、化学合成法、提取法等。化学合成法面临的主要问题是工艺路线较长，副产物多，收率低。γ-PGA作为一种高分子聚合物，其许多物理化学性质与分子量密切相关，采用化学合成法得到的γ-PGA分子量较低，而提高产物分子量必将大大降低产率，因此，该方法不具备实际应用价值。提取法由于γ-PGA固有的特性，使得提取工艺复杂，成本较高，无法大规模生产。γ-PGA的制备方法主要集中在微生物发酵合成，微生物发酵法工艺简单、培养条件温和、周期短且适合于大规模生产，因此，微生物发酵法是目前制备γ-PGA最具有工业化前景的生产方法。但该方法产量不高是制约其大规模工业生产的主要原因。

发明内容

本发明目的在于提供一种大量生产γ-聚谷氨酸的诱变菌株枯草芽孢杆菌及其培养方法。

为实现上述目的，本发明采用技术方案为：

一种大量生产γ-聚谷氨酸的诱变菌株枯草芽孢杆菌，所述枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)SY-ND-SFX029已于2013年3月8日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所），保藏编号为：CGMCC No.7288。

所述菌株以纳豆中筛选出的枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）菌株SY-ND为出发菌株经常压室温等离子体诱变后得到；其中枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）菌株SY-ND已于2011年9月6日该菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所），保藏编号为：CGMCC No.5224。

大量生产γ-聚谷氨酸的诱变菌株枯草芽孢杆菌的培养方法，将所述诱变菌株枯草芽孢杆菌于保藏培养基中，在30-37℃活化12-24h；活化后菌株于种子培养基中，于30-37℃，100-150rpm下培养1-2天，作为种子液；将所得种子液以4-8%（v/v）接种比例接种于发酵培养基中，在30-37℃下，100-150rpm振荡培养2-4天。

所述保藏培养基（LB培养基）：胰蛋白胨10g/L，酵母浸粉5g/L，NaCl10g/L，琼脂15-20g/L，蒸馏水1.0L，pH7.2；

所述种子培养基：蛋白胨6-15g/L，葡萄糖5-10g/L，酵母膏3-10g/L，NaCl5-8g/L，pH6.0-7.0，K₂HPO₄0.5-1g/L，KH₂PO₄0.5-1g/L,MgSO₄0.5-1g/L，水1.0L；