[发明专利]一种超双元载体、构建方法及其应用

权利要求书

1.超双元载体pDT1301，其骨架载体为去除潮霉素抗性基因的pCMBIA1301载体，即pCMBIA1301-hpt^-，具有一个T-DNA区，其特征在于：在该骨架载体T-DNA区的多克隆位点处插入序列片段，使原来T-DNA区从左边界到右边界依次被分成T-DNA1区和T-DNA2区，所述序列片段的5’端为右边界序列RB，3’端为左边界序列LB，中间相连的为无关序列；所述T-DNA2中通过限制性酶切位点插入含有潮霉素抗性基因hpt II的片段，所述RB序列如SEQ ID NO13所示，所述LB序列如SEQ ID NO14所示。

2.根据权利要求1所述的超双元载体，所述序列片段如SEQ ID NO1所示。

3.根据权利要求2所述的超双元载体，所述T-DNA2区中插入的片段如SEQ ID NO6所示。

4.RNA干扰载体，命名为pDT1301-DR，其特征在于：在权利要求2所述的超双元载体的T-DNA1区插入有水稻条纹病毒（Rice stripe virus，RSV）和水稻黑条矮缩病毒(Rice black streaked dwarf virus，RBSDV)外壳蛋白（Coat protein,CP）基因部分核苷酸序列（RSV-RBSDV-HCP）的发夹结构，该发夹结构的序列如SEQ ID NO15所示。

5.权利要求3所述的超双元载体的构建方法，包括如下步骤：（1）将序列SEQ ID NO1插入在骨架载体pCMBIA1301-hpt^-的限制性酶切位点Xba I和Sal I间，形成两个T-DNA区，分别命名为T-DNA1和T-DNA2区，得到不含有潮霉素抗性基因的中间载体I，命名为pCMBIA1301-hpt^--DT；（2）再通过限制性酶切位点Nco I将含潮霉素抗性基因hpt II的基因片段SEQ ID NO6所示的连入pCMBIA1301-hpt^--DT载体的T-DNA2中，获得了含有潮霉素的超双元载体，该载体命名为pDT1301。

6.根据权利要求5所述的构建方法，所述步骤（2）的具体方法为：（A）以pCMBIA1301为模板，以序列SEQ ID NO4和SEQ ID NO5为引物对，经PCR扩增得到携带酶切位点Nco I的潮霉素抗性基因（hpt II），并连入pMD18-T载体，经测序验证的载体命名为pMD18-T-hpt；（B）将载体pMD18-T-hpt采用Nco I酶切，电泳、回收hpt II片段；再在T4连接酶作用下，与经去磷酸化的Nco I酶切pCAMBIA1301-hpt^--DT产物连接，经PCR鉴定插入正确的载体命名为pDT1301。

7.权利要求4所述的RNA干扰载体pDT1301-DR的构建方法，步骤如下：（1）以中间载体pMCG161+/-D为模板，以序列SEQ ID NO9和SEQ ID NO10为引物对，经PCR扩增得到含有RSV-RBSDV-HCP序列、水稻Intron和酶切位点Xho I的发夹结构；（2）将PCR产物经Xho I酶切、连入同样经过Xho I酶切的载体pDT1301的T-DNA1区内，获得兼抗RSV和RBSDV的RNA干涉载体pDT1301-DR。

8.权利要求1-3任一所述的超双元载体在遗传转化中的应用。

9.根据权利要求8所述的应用，为将目的基因或发夹结构插入T-DNA1区中，采用农杆菌介导转化法转化禾本科植物，得到转基因植株，再通过T1代自交分离得到无选择标记基因的转基因植株。

10.根据权利要求9所述的应用，所述目的基因为水稻条纹病毒（Rice stripe virus，RSV）和水稻黑条矮缩病毒(Rice black streaked dwarf virus，RBSDV)外壳蛋白（Coat protein,CP）基因部分核苷酸序列RSV-RBSDV-HCP的发夹结构，该发夹结构的序列如SEQ ID NO15所示，所述禾本科植物为水稻。