[发明专利]表达融合外源表位N蛋白的重组小反刍兽疫病毒的构建及应用

说明书

技术领域

本发明涉及免疫标记疫苗领域。具体地，本发明涉及表达融合外源表位N蛋白的重组小反刍兽疫病毒的构建及应用。

背景技术

小反刍兽疫(Peste des petits ruminants，PPR)是由副黏病毒科麻疹病毒属的小反刍兽疫病毒(peste des petits ruminants virus，PPRV)引起的急性、烈性传染病；临床以发热、口炎、腹泻和肺炎为特征。对山羊和绵羊等小反刍动物危害严重，给畜牧业造成重大经济损失[1]。PPR于2007年传入我国西部边境地区，导致局部疫情，对我国畜牧养殖业形成严重威胁。小反刍兽疫病毒基因组为不分节段的单股负链RNA，基因组长15948bp。从3’至5’依次分布着N、P、M、F、H、L基因，分别编码核蛋白(N)、磷酸蛋白(P)、基质蛋白(M)、融合基质蛋白(F)、血凝素蛋白(H)和大聚合蛋白(L)这六种结构蛋白，P基因还编码两种非结构蛋白C和V。N蛋白为小反刍兽疫病毒的核衣壳蛋白，是PPRV中含量最丰富和免疫原性最强的结构蛋白，在病毒的复制和转录中起主要的作用，其抗原性稳定，在病毒感染的动物血清中针对N蛋白的抗体占主导地位，主要用于检测诊断研究[2-4]，是引入外源表位用以构建标记疫苗的合适靶蛋白。

防治小反刍兽疫的主要措施就是进行疫苗免疫接种。常用的PPRV疫苗株Nigeria 75/1是在Vero细胞上多次传代致弱所获得，是一种安全经济的疫苗，但该疫苗的缺陷在于无法区分自然感染动物与免疫接种动物[5]。我国西部小反刍兽疫疫情的防控需要有效的血清学监控，因此标记疫苗的研制有其必要性和紧迫性。本研究室小反刍兽疫病毒反向遗传操作平台的建立为小反刍兽疫标记疫苗的构建提供全新的技术途径[6]，在此基础之上本研究于PPRV N蛋白羧基端分别引入HA、FLAG、5B19表位，利用反向遗传操作技术，分别成功拯救出表达融合外源表位N蛋白的重组病毒，并对重组病毒的生物学特性进行了研究。

发明内容

核衣壳蛋白(nucleocapsid，N)是小反刍兽疫病毒(peste des petits ruminants virus，PPRV)中含量最丰富和免疫原性最强的结构蛋白，是引入外源表位用以构建标记疫苗的合适靶蛋白。为构建小反刍兽疫标记疫苗，首先分别构建了在N蛋白羧基端引入外源表位(HA：YPYDVPDYA；FLAG：DYKDDDDK；小鼠肝炎病毒S2糖蛋白的优势B细胞表位5B19：SPLLGCIGSTCAEDGN)的融合基因N^HA、N^FLAG、N^5B19，并克隆至pCAGGS载体，以其替代PPRV反向遗传拯救系统中的表达天然PPRV N蛋白的辅助质粒后仍能够成功拯救出小反刍兽疫病毒，且拯救效率前后相差无几，表明融合外源表位后对N蛋白的功能影响不大。随后分别以N^HA、N^FLAG、N^5B19基因替换PPRV感染性克隆中的N基因，体外救获表达融合外源表位N蛋白的重组病毒。蛋白印迹试验和间接免疫荧光试验表明分别融合外源表位的N蛋白获得了正确表达；体外生长动力学试验分析表明重组病毒的生长最高滴度虽比亲本毒低，但并不影响其今后作为标记疫苗的使用。小鼠免疫试验表明，本研究构建的三种标记疫苗rPPRV/GFP/N^HA、rPPRV/GFP/N^FLAG、rPPRV/GFP/N^5B19都能够诱导特异性的针对外源表位的抗体，具有显著的标记作用，同时诱导的PPRV病毒中和抗体能够100％转阳。这些结果初步表明标记疫苗在山羊、绵羊等小反刍动物上使用的使用价值，不但能够提供区别自然感染和疫苗免疫感染的外源标记基因的抗体，还能够提供显著的PPRV病毒中和抗体以预防小反刍兽疫，是预防小反刍兽疫的新一代的标记弱毒疫苗。

更具体地，本发明提供以下各项：