[发明专利]一种嵌段聚合物固定化酶的制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种嵌段聚合物固定化酶的制备方法。

背景技术

游离酶的催化活性易受到pH、温度、有机溶剂、重金属离子等因素的影响。而酶的固定化技术能有效提高酶在极端条件下的稳定性和催化活性，同时易于回收再利用。固定化酶的材料和方法有很多种，其中纳米材料固定化酶因其高载酶量受到了研究者的青睐，尤其是一些具有多孔结构、大比表面积的载体材料有利于提高固定化酶的载酶量，并有利于底物向酶活性中心和产物向反应区域以外扩散以提高固定化酶的生物活性和催化效率。

传统粉状或颗粒状纳米材料存在分离和回收的难题，同时排放到环境中会造成污染，而具有空间连续性的纳米纤维膜作为固定化酶的载体具有较大的比表面积和高孔隙率，并且可以通过纺丝条件进行调控等优点，越来越引起人们的重视。近年来，利用电纺纳米纤维固定化酶成为一个新兴研究热点。CN200610052953.8通过静电纺丝和碱处理的方法，可以得到一种在水溶液中具有稳定形态结构的壳聚糖纳米纤维膜。CN200410019230.9将壳聚糖与聚乙烯醇的混合溶液静电纺丝制备超细纤维复合膜。Huang 等人利用胶原蛋白等生物大分子对聚（丙烯腈-丙烯酸）纳米纤维膜进行表面改性，并用于脂肪酶的固定化(Huang XJ, Yu AG, Jiang J, Pan C, Qian JW, Xu ZK, J. Mol. Catal. B:Enzym. 2009, 57:250-256)。然而上述纳米纤维膜载体及其固定化酶存在制备工艺比较繁琐、机械强度不够、很难大规模生产和应用等缺点。

所以有必要研制一种制备工艺简单、具有一定机械强度、有工业化生产潜力的纳米纤维膜固定化酶，同时提高固定化酶的载酶量、催化稳定性和重复使用性。

发明内容

 针对一些固定化酶载体的载酶量和催化效率低、固定化酶过程繁琐和载体材料难以回收等问题，本发明的目的在于提供一种具有高比表面积、高空隙率、具有一定机械强度和制备工艺简单的嵌段聚合物固定化酶的制备方法。

本发明提出的嵌段聚合物固定化酶的制备方法，具体步骤如下：

 (1)制备聚甲基丙烯酸甲酯-丙烯酸乙酯纳米纤维膜

将聚甲基丙烯酸甲酯-丙烯酸乙酯嵌段聚合物溶于N,N-二甲基甲酰胺和四氢呋喃组成的溶液中，配成重量百分比为5%~15%的溶液，充分溶解后，注入到静电纺丝装置中，在电压为15~25千伏，喷丝头溶液流量为0.5~1.5毫升/小时、接收距离为10~20厘米的条件下进行电纺丝，获得纤维直径为100~500nm的甲基丙烯酸甲酯-丙烯酸乙酯纳米纤维膜，将纳米纤维膜在真空干燥箱中在30℃~50℃的条件下干燥5小时~10小时，即得聚甲基丙烯酸甲酯-丙烯酸乙酯纳米纤维膜；其中：N,N-二甲基甲酰胺和四氢呋喃的质量比为1:1~1:4；

(2)将步骤(1)所得的聚甲基丙烯酸甲酯-丙烯酸乙酯纳米纤维膜浸入 1%~10%的聚乙二胺水溶液中，密封后于70℃的恒温条件下震荡1~3小时，震荡速度为30~120转/分钟；取出处理后的聚甲基丙烯酸甲酯-丙烯酸乙酯纳米纤维膜并用pH为7.0的磷酸盐缓冲溶液充分冲洗，以除去膜上残余的聚乙二胺；将胺化之后的聚甲基丙烯酸甲酯-丙烯酸乙酯纳米纤维膜浸入1%~5%的戊二醛水溶液中，密封后于25℃恒温条件下震荡1~2小时，震荡速度为30~120转/分钟；

(3)将步骤(2)所得聚甲基丙烯酸甲酯-丙烯酸乙酯纳米纤维膜用pH为7.0的磷酸盐缓冲溶液充分冲洗，以除去膜上残余戊二醛；将经过戊二醛活化的纳米纤维复合膜浸没于浓度为0.1~2毫克/毫升的酶磷酸盐缓冲溶液中，密封后于4℃的恒温条件下震荡1~5小时，震荡速度为30~120转/分钟；从溶液中取出纳米纤维膜，用去离子水反复冲洗3~5次，即可得到聚甲基丙烯酸甲酯-丙烯酸乙酯纳米纤维膜固定化酶；将固定化酶的纳米纤维膜浸入pH为7.0的磷酸缓冲溶液中，于4℃下储存备用。

本发明中，所述聚甲基丙烯酸甲酯-丙烯酸乙酯的重均分子量为8~12万，数均分子量为2~5万。

本发明中，步骤(3)中所述酶磷酸盐缓冲溶液中所用的酶为：漆酶、过氧化物酶、蛋白酶、淀粉酶或脂肪酶中的一种。

本发明的有益效果在于：

（1）聚甲基丙烯酸甲酯-丙烯酸乙酯纳米纤维膜的制备及其酶固定化工艺简单。

（2）聚甲基丙烯酸甲酯-丙烯酸乙酯纳米纤维膜具有高比表面积和高空隙率，有利于提高固定化酶的载酶量和提高固定化酶的催化效率。