[发明专利]抗三疣梭子蟹颗粒血细胞26.7kDa蛋白的单克隆抗体及其制备方法

权利要求书

1.一种抗三疣梭子蟹颗粒血细胞26.7kDa蛋白的单克隆抗体，其特征在于所述的单克隆抗体是由名称为：杂交瘤细胞株Crab，保藏号为：CCTCC NO: C2012196，保藏单位为：中国典型培养物保藏中心，保藏日期为：2013年01月07日的杂交瘤细胞分泌的。

2.根据权利要求1所述的抗三疣梭子蟹颗粒血细胞26.7kDa蛋白单克隆抗体的制备方法，其特征在于它包括以下步骤：抽取三疣梭子蟹血淋巴，离心得到全血细胞；全血细胞经Percoll介质连续密度梯度分离法得到三疣梭子蟹颗粒血细胞；以三疣梭子蟹颗粒血细胞为样品进行十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳，对26.7kDa蛋白条带进行蛋白提纯；以提纯的三疣梭子蟹颗粒血细胞26.7kDa蛋白作为抗原，免疫Balb/C小鼠；取免疫小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合；间接免疫荧光抗体法筛选阳性杂交瘤细胞株，对阳性杂交瘤细胞株进行克隆，最后筛选得到一株能稳定分泌抗三疣梭子蟹颗粒血细胞26.7kDa蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株Crab；其分泌的抗体为抗三疣梭子蟹颗粒血细胞26.7kDa蛋白的单克隆抗体，经流式免疫荧光法和转印免疫印迹法验证其单抗特性。

3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于所述的Percoll介质连续密度梯度分离法是将三疣梭子蟹全血细胞悬液铺于Percoll介质连续密度梯度的顶层，离心分离所得自上而下的第三层细胞带即为颗粒血细胞带。

4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于所述的间接免疫荧光抗体法是将融合杂交瘤细胞培养上清液分别与三疣梭子蟹全血细胞血滴片、透明血细胞血滴片和颗粒血细胞血滴片反应，而后避光条件下加入异硫氰荧光素标记羊抗小鼠IgG抗体，荧光显微镜下观察、筛选抗颗粒血细胞单克隆抗体，即单抗Crab。

5.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于所述的流式免疫荧光法是将制备的单克隆抗体分别与三疣梭子蟹透明血细胞悬液、颗粒血细胞悬液反应，而后避光条件下加入异硫氰荧光素标记羊抗小鼠IgG抗体，流式细胞仪检测验证制备的单克隆抗体为抗三疣梭子蟹颗粒血细胞的单克隆抗体。

6.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于所述的转印免疫印记法是将凝胶蛋白进行电转移至硝酸纤维素膜上，将硝酸纤维素膜浸入制备的单克隆抗体中，而后将其浸入碱性磷酸酶标记的羊抗小鼠IgG抗体中，发色液显色观察条带，确定抗原决定簇的分子量。