[发明专利]一种化学发光试剂

说明书

技术领域

本发明涉及一种化学发光试剂，尤其是涉及主要用于生物技术、生命科学、医疗诊断、食品安全、环保检测中的一种化学发光试剂。

背景技术

化学发光是指在化学反应过程中产生可见光的一种现象，通常是指一些化合物在没有紫外光或可见光照射的情况下，通过吸收化学能，从基态激发至激发态，在退激时释放能量产生光子，实现化学能到光能装换，从而导致发光的现象。通过测量化学发光反应的光强度，可分析痕量化合物的含量。近年来发展起来的化学发光免疫检测技术(chemiluminescent immunoassay，CLIA)是化学发光技术与免疫学方法相结合的产物，不但具有发光检测的高度灵敏性，而且还具有免疫分析的高度特异性。同时，化学发光免疫检测技术不仅检测快速、可实现高通量检测，而且避免传统的放射性标记试剂的使用，从而避免放射性危害，减少对环境的冲击。化学发光免疫检测技术的检测灵敏度是目前光学检测中最好的技术之一，最低检测限（LOD）可达10^-21mol／L。

目前最广泛的化学发光检测技术可分为板式化学发光和管式化学发光。板式化学发光使用抗体包被的96孔或更多孔的多孔板，通过抗体-抗原的特异性作用把检测目标（抗原）从样品中提取出来，加入化学发光标记的抗体后形成“三明治（sandwich）”夹心层。根据化学发光标记种类的不同，板式化学发光既可是酶促化学发光，也可是非酶促化学发光。酶促化学发光技术使用酶标记，常用的酶有辣根过氧化物酶(horse radish peroxidase,HRP)、碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)、黄嘌呤氧化酶等。其最大特点是通过酶的催化作用放大发光信号，从而提高检测灵敏度；同时，发光过程中作为标记物的酶基本不被消耗，而反应体系中发光底物试剂充分过量，发光信号强而稳定，发光时间较长，可采用速率法测量。因此，酶促化学发光检测方式简单、成本较低、灵敏度高。非酶促化学发光技术也被称之为直接化学发光，使用吖啶脂或异鲁米诺（如aminobutylethylisoluminol，ABEI），特点是不使用生物酶、可简化化学发光检测过程、降低试剂成本，但在其发光过程中作为标记物的发光剂会被消耗，导致发光信号持续时间较短。另外，由于发光剂被很快消耗，只能进行一次性测量，因此重复性较差。

板式化学发光在生命科学、生物医药、食品安全、环保检测等领域有着广泛的应用。管式化学发光则是最近发展起来的一种新型化学发光检测技术，使用磁性或非磁性微粒作包被载体。比起板式化学发光来说，管式化学发光有着不少优势，特别是使用磁性微粒的管式发光技术，在大型、全自动的诊断仪上有着广泛的应用。当然，管式化学发光也有其弱点，包括如何降低散射作用对检测灵敏度的影响、如何控制磁性微粒体积分布均匀、如何保证磁性微粒-抗体共轭体的质量、如何避免磁性微粒的聚合问题等。

鲁米诺-HRP系统是化学发光检测最常见的技术。下述方案1描述的是鲁米诺的发光反应机制（J.Pharma.& Biomed.Anal.1994,12,433-462）：鲁米诺发光机制中的一个关键中间体是杂环被氧化的α-羟基过氧化物（α-hydroxyperoxide），此中间体的分解导致处于激发态中间体的产生，激发态中间体回归到基态时产生发光。产生α-羟基过氧化物的第一步反应与系统介质紧密相关，如总体浓度、氧化剂的性质、添加物、缓冲液及pH。在质子溶液（水、水溶液、含水醇溶液等）中，各种氧化物（分子氧、过氧化物、超氧阴离子）都可氧化鲁米诺，但都需要酶或矿物催化剂。与此相反，发光过程（第二步及第三步）所涉及的α-羟基过氧化物的分解过程非常独特，只依赖于系统的pH值。

方案2所描述的则是辣根过氧化酶的催化机制：HRP与过氧化氢反应形成一种氧化的HRP（HRPI），HRPI和鲁米诺阴离子反应形成半还原的酶（HRPII）及鲁米诺自由基。HRPII同另一分子的鲁米诺反应，变回原始的HRP（J.Pharma.& Biomed.Anal.1994,12,433-462）。此过程产生鲁米诺自由基，而鲁米诺自由基的产生效率与其发光效率直接相关。

方案1.简化的鲁米诺反应机制：在碱性条件下，鲁米诺被氧化成关键中间体α-羟基过氧化物（α-hydroxyperoxide）（第一步）；失去氮气（N2）后此中间体分解成激发态的邻苯二甲酸（第二步），当激发态的邻苯二甲酸回到基态伴随着光的产生（第三步）。