[发明专利]一种细毛羊毛囊干细胞分离培养方法

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种细毛羊毛囊干细胞分离培养方法。

背景技术

体外培养细毛羊毛囊干细胞，对于探讨与其生长相关的因子、激素等作用机理，改善羊毛品质，提高产毛量具有重要的经济意义和价值。毛囊干细胞(hair follicle stem cells，FSC)被认为是慢循环细胞(slow cycling cell)或极少循环细胞(rarely cycling cell)，具有干细胞的一般特点，即自我复制性(self-renew)和多项潜能性(multi-potent)，可分化成毛囊、皮脂腺和表皮，对毛发的再生以及毛色的影响起着重要的作用(Wakayamat等，2001)。目前多数研究认为毛囊干细胞位于毛囊的隆突部和外根鞘的最外层。毛囊隆突部的细胞具有干细胞的特征，在培养状态下毛囊隆突部位的细胞克隆形成能力强。国内外学者运用细胞培养技术，将毛囊隆突部分离出来，并成功培养毛囊隆突部干细胞(Taylor等，2000；Zhang等，2006；Honda等，2006)。毛囊(Hair follicle)是表皮向真皮凹陷后形成的能控制毛发生长的皮肤附属器官，是由胚胎期神经外胚层与间充质相互作用，最终发育形成的由多层细胞组成的、具有合成多种特异角质蛋白功能的复杂的动态器官，具有独特的结构和周期性再生的能力。毛囊在形成和分化过程中至少涉及到20余种不同的细胞群，主要由毛乳头、毛母质、内根鞘和外根鞘等细胞组成。其中，外根鞘细胞(Outer root sheath cell，ORSC)作为一种重要的毛囊上皮细胞，因具有高度增生的潜能，在毛发再生、伤口愈合、初级毛囊和次级毛囊分化等生理过程中均起着重要作用，因而越来越受到高度关注。毛囊是控制毛发周期性生长的重要结构，它是一个多层细胞组成的特殊器官，而细毛羊的羊毛品质及产量都取决于绵羊皮肤组织结构和毛囊性状。但是如何在体外培养中大量获得毛囊隆突部干细胞，且尽量减少其分化，仍是有待解决的问题。体外分离培养细毛羊毛囊干细胞，建立良好的培养体系，对于阐明细毛羊毛囊干细胞生物学特性和探讨毛囊的生长调节机制具有重大意义，在畜牧生产上也有着广阔的应用前景。

毛发的周期性自我更新以及生长依赖于毛囊干细胞的周期性增殖和分化(Paus等，2004)。Taylor等(2000)通过3H-TdR等一系列标记细胞试验提出假设：毛囊隆突部可能是干细胞贮存处。Morris等(1994)通过放射性BrdU标记技术，发现约10％左右标记滞留细胞(label retaining cells，LRCs)存在于表皮基底细胞层中，而其他绝大多数阳性细胞存在于毛囊外根鞘隆突部位。Oshima等(2001)通过转基因鼠证实每个毛发周期中毛母质细胞是隆突部HFSCs来源的，此后不断有研究证实HFSCs定位于隆突部(Ohyama，2007；Waters等，2007)。Levy等(2005)利用显微解剖、组织切片以及皮片异种移植模型研究发现，鼠毛囊隆突部为其外根鞘一系列不连续隆起，人毛囊隆突部位于其外根鞘最外层靠近立毛肌插入点处。研究者将毛囊经胰酶消化后，利用胶原包被法培养外根鞘细胞获得成功。Jones等(1996)利用干细胞对细胞外基质的粘附性进行了体外分离、纯化表皮干细胞的实验，采用快速粘附于VI型胶原的方法成功的富集了表皮干细胞(Bickenbach等，1999)。Zhang等(2006)利用中性分散酶分离毛囊隆突区，培养获得了毛囊隆突区干细胞。到目前为止，体外外根鞘细胞培养技术较成熟，应用最广的是显微分离培养法。但是，由于毛囊干细胞存在部位隐蔽，获得的外根鞘细胞中毛囊干细胞数量十分有限，限制了毛囊干细胞的研究。

发明内容

本发明的目的是克服现有技术存在的缺陷，提供一种细毛羊毛囊干细胞分离培养方法，建立与完善细毛羊体外培养细毛羊毛囊干细胞系(Fine wool sheep hair follicle stem cell line)的构建方法，不仅可为阐明毛囊的生长发育规律、影响因素及其调控机制提供研究模型；为提高细毛羊毛产量和羊毛品质的育种改良奠定基础；还可以为提高羊毛品质、数量和毛皮花纹品质乃至医学领域的人类毛发再生研究等奠定基础。

其技术方案如下：

一种细毛羊毛囊干细胞分离培养方法，包括如下步骤：