[发明专利]一种适用于毛细管柱上检测的偏心聚焦型激光诱导荧光检测装置的检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及的领域为分析仪器研究领域，特别是涉及一种适用于毛细管柱上检测的偏心聚焦型激光诱导荧光检测方法与装置。

背景技术

本专利涉及的是有关适用于毛细管柱上检测的高灵敏荧光检测系统的研究。激光诱导荧光检测（Laser induced fluorescence, LIF）是化学分析领域最灵敏的检测技术之一。与其他检测技术相比，激光诱导荧光检测具有以下优点：超微样品检测体积（皮升至飞升级）、高灵敏度、高特异性、高重现性。更重要的是，将激光诱导荧光检测系统与高分辨率分离技术相结合（例如毛细管电泳、毛细管液相色谱），其应用领域从分析化学扩展到了生物医学领域，如基因组学、蛋白质组学、单分子及单细胞分析、以及临床诊断等，并对这些学科的发展产生了较大的推动作用。

激光诱导荧光检测（LIF）的灵敏度主要受到来自于光学元件及溶剂的背景信号的影响（Ambrose W P, Goodwin P M, Jett J H, et.al. Chem. Rev. 1999, 99, 10,  2929-2956）。因此，提高LIF检测系统灵敏度的主要途径是尽量地降低检测系统的背景信号强度。目前，已有各种方法来降低背景信号。例如设计具有鞘流池的正交光路系统（Cheng Y F, Dovichi N J., Science 1988, 242, 4878, 562-564）；使用高性能的荧光发射滤光片或者滤光片组合（Jiang G F, Attiya S, Ocvirk G, Lee W E, Harrison D J., Biosens. Bioelectron. 2000, 14, 10, 861-869）；以及使用远红外激光激发（Soper S A, Mattingly Q L, Vegunta P., Anal. Chem., 1993, 65, 6, 740-747）等方法。然而，这些方法往往存在光学结构相对复杂、操作繁琐、设备昂贵、适用性不强等缺点。

目前，激光诱导荧光检测器的光路结构主要分为正交型光路结构（Cheng Y F, Dovichi N J., Science 1988, 242, 4878, 562-564）和共焦型光路结构（Jiang G F, Attiya S, Ocvirk G, Lee W E, Harrison D J., Biosens. Bioelectron. 2000, 14, 10, 861-869）。共焦型光路结构具有易于搭建、集成度高、易于微型化、灵敏度高的特点，因此广泛应用于商品化的激光诱导荧光检测器中。然而，在将共焦型激光诱导荧光检测器用于毛细管电泳和毛细管色谱系统的柱上检测器时，常常难以获得较低的检测限。这是由于石英毛细管材料与空气的折射率指数相差较大，当激发光入射到圆形毛细管上时，会在毛细管的内外表面产生较强的反射光和散射光，造成较高的检测背景信号。并且，由于圆柱形毛细管存在的透镜效应，对激光光束产生较大的光学畸变，从而导致难以采用小孔空间滤波的方法降低背景信号。

为了提高用于毛细管柱上共焦荧光检测系统的灵敏度，Lundqvist等人（Lundqvist, A., Chiu, D. T., Orwar, O., Electrophoresis, 2003, 24, 1737–1744）在毛细管和聚焦透镜之间填充与毛细管折射率接近的油相液体，来降低由于折射率相差较大导致的界面反射和散射造成的高检测背景，从而提高检测灵敏度。并且，为了匹配高倍数的油镜，他们还将毛细管进行了拉细处理，使其内径至0.8–8 微米。尽管这种方法可有效提高检测灵敏度，但是其采用的超细内径的毛细管加工困难、容易堵塞，且比较脆弱，易折断，因而限制了该方法在常规实验和商品化仪器中的进一步应用。

发明内容

本发明的所要解决的技术问题是提供一种适用于圆形毛细管柱上检测的激光诱导荧光检测方法和装置。该方法具有检测灵敏度高、光学结构简单、易加工和搭建、易于集成化和微型化，特别适用于基于圆形毛细管的电泳和色谱分离系统的柱上检测。

本发明的具体技术方案是：