[发明专利]甲型H7N9流感病毒检测试剂盒及检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种H7N9病毒的检测方法及检测试剂盒。

背景技术

2013年3-4月份，我国华东多地突发人感染禽流感疫情，多人致死，并逐渐扩散传播到多地。截至5月1日，已确诊H7N9禽流感病例127例，26人死亡，涉及北京、上海、江苏、浙江、安徽、江西、湖南、山东、福建和河南等省市。研究证实，该次疫情的致病源是一种新型的基因重组H7N9型禽流感病毒。目前均为散发病例，尚未发现病例间有流行病学关联。传染源目前尚不明确，根据以往经验及本次病例流行病学调查，推测可能为携带H7N9禽流感病毒的禽类及其分泌物或排泄物。病毒经呼吸道传播，也可通过密切接触感染的禽类分泌物或排泄物等被感染，直接接触病毒也可被感染。现尚无人与人之间传播的确切证据。

甲型H7N9流感病毒属正粘病毒科甲型流感病毒属，病毒颗粒呈多形性，其中球形直径80～120nm，有囊膜。基因组为分节段单股负链RNA。依据其外膜血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)蛋白抗原性不同，目前可分为16个H亚型(H1～H16)和9个N亚型(N1～N9)。禽流感病毒除感染禽外，还可感染人、猪、马、水貂和海洋哺乳动物。可感染人的禽流感病毒亚型主要为H5N1、H9N2、H7N7、H7N2、H7N3，此次报道的为人感染H7N9禽流感病毒。该病毒为新型重配病毒，其内部基因来自于H9N2禽流感病毒。该病毒的血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)基因分别为H7，N9型，但其他基因片段与H9N2流感病毒同源。

此次人感染H7N9禽流感，目前尚无确切证据显示人类对H7N9禽流感病毒易感。现有确诊病例均为成人。根据流感的潜伏期及现有H7N9禽流感病毒感染病例的调查结果，潜伏期一般为7天以内。患者一般表现为流感样症状，如发热，咳嗽，少痰，可伴有头痛、肌肉酸痛和全身不适。重症患者病情发展迅速，表现为重症肺炎，体温大多持续在39℃以上，出现呼吸困难，可伴有咯血痰；可快速进展出现急性呼吸窘迫综合征、纵隔气肿、脓毒症、休克、意识障碍及急性肾损伤等。

综上，亟需能够实现快速、有效且准确检测H7N9禽流感病毒的产品，以用于人感染H7N9禽流感疫情的防控和流行病学调查。流感病毒检测的“金标准”是病毒培养，但病毒培养操作复杂，实验室硬件要求高，周期长，阳性率低，限制了其应用。目前尚无成型的快速检测试剂盒，本文描述了一种H7N9病毒快速检测试剂盒。该试剂盒采用一步荧光RT-PCR方法，可对鼻咽或口咽洗液或拭子、支气管肺泡灌洗液、气管抽吸物、痰或胸水样本中甲型H7N9禽流感病毒(2013)RNA进行定性检测，可用于临床对甲型H7N9禽流感病毒(2013)感染的辅助诊断及药物治疗效果的监测。

发明内容

本发明的目的在于提供一种甲型H7N9流感病毒检测试剂盒及检测方法，以实现快速检测该病毒。

本发明提供的一种甲型H7N9流感病毒检测试剂盒，是对甲型H7N9流感病毒MP、HA、NA、NP基因设计特异性引物和探针，在样本RNA核酸纯化之后采用荧光PCR对病毒RNA进行检测，以达到对流感病毒的确认、初步分型以及是否H7N9型的最终确定。该试剂盒包括特异性引物和探针，所用引物和探针核苷酸序列分别如下：

甲型流感病毒通用型检测体系(5’-3’)：

Infa-F1(W)：CGATCCTGTCACCTCTGACTAAG，

Infa-R1(W)：AGGGCATTTTGGCAAAGC，

Infa-FP1(W)：FAM-TGCCCAGTGAGCGAGGACTGC-BHQ1，

RnaseP-F1：CGCGGACAATGGCACTC，

RnaseP-R1：CGCACCAGCTCTTCCTCA，

RnaseP-FP1：HEX-ATGTCACTCTTCACAGTCAGCGGC-BHQ1；

H7检测体系：

rH7(S)-F5：CATTCCGACAAATGCAGACAA，

rH7(S)-R5：CACTCCTCTTTCAGTTAATGTGTTTACTTT，

rH7(S)-FP5：FAM-ATCTGCCTCGGACATCATGCTGTGTC-BHQ1，

RnaseP-F1：CGCGGACAATGGCACTC，

RnaseP-R1：CGCACCAGCTCTTCCTCA，

RnaseP-FP1：HEX-ATGTCACTCTTCACAGTCAGCGGC-BHQ1；

N9检测体系：