[发明专利]一种高效表达重组普鲁兰酶的枯草芽孢杆菌及其获得方法

权利要求书

1.一种能够以整合型的方式表达普鲁兰酶的重组枯草芽孢杆菌菌株，其特征在于，其获得方法为：

将普鲁兰酶表达元件克隆到枯草芽孢杆菌整合质粒上，得到的重组质粒转化宿主枯草芽孢杆菌，挑选外源基因通过双交换整合到枯草芽孢杆菌染色体中的重组枯草芽孢杆菌；

所述的外源普鲁兰酶表达元件包含如下组分：能够在枯草芽孢杆菌中高效启动基因表达的启动子，能在枯草芽孢杆菌中高效分泌表达蛋白的信号肽DNA片断和普鲁兰酶基因；

所述的能够在枯草芽孢杆菌中高效启动基因表达的启动子为来源于枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）重叠启动子P43，或来源于枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）甘油三磷酸脱氢酶基因glpD的启动子；

所述的能在枯草芽孢杆菌中高效分泌表达蛋白的信号肽DNA片断为来源于高温产硫化氢梭状芽孢杆菌(Clostridium thermosulfurogenes)的β-淀粉酶基因信号肽DNA片断，或来源于短芽孢杆菌（Bacillus brevis）的ɑ-乙酰乳酸脱羧酶基因信号肽DNA片断；

所述的海藻糖合成酶基因为来源于长野芽胞杆菌（Bacillus naganoensis)的普鲁兰酶基因，或来源于粘液硫还原球菌（Desulfurococcus mucosus）的普鲁兰酶基因；

所述的枯草芽孢杆菌整合质粒为整合质粒pMLK83及其衍生质粒，或pAX01及其衍生质粒；

所述的宿主枯草芽孢杆菌是枯草芽孢杆菌168衍生菌株，包括1A751,WB600,和WB800。

2.根据权利要求1所述的一种能够以整合型的方式表达普鲁兰酶的重组枯草芽孢杆菌菌株，其特征在于，用其来生产普鲁兰酶的操作步骤如下：

1）一级种的制备：将菌株单菌落在4ml LB液体培养基37℃、220rpm培养过夜，所得的菌种为一级种；

2）二级种的制备：将一级种接种于800ml LB液体培养基，于37℃，220rpm培养至OD600为0.6左右（培养4～5小时）；

3）三级种的制备：将二级种接种到80L LB液体发酵罐中，37℃，以柠檬酸、NaOH控pH7.0左右，通风搅拌，溶氧控制在20～30%，培养至OD600为0.6左右（培养5～6小时）；

4)生产罐发酵：将三级种接种到3T发酵罐中，LB液体培养基，36～38℃，通风搅拌，溶氧控制在20～30%，以柠檬酸、NaOH控pH6～8,培养约26小时,10000g离心力离心除菌,用截留分子量5000～10000超滤膜浓缩上清液后，即得普鲁兰酶浓缩原液。