[发明专利]一种检测药物包裹或释放过程的单分子分析方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种检测药物包裹或释放过程的单分子分析方法，属于单分子分析技术领域。

背景技术

环糊精分子呈环形笼状结构，外表面具有很强的亲水性，内部空腔具有很强的疏水性，这种特殊结构和性质使它在医药等领域具有广泛的应用，主要包括改善药物的水溶性，作为药物载体或赋型剂通过主-客体相互作用包裹疏水性药物分子等。客体药物活性分子能够通过疏水作用力、范德华力和氢键等嵌入β-环糊精疏水内腔，形成单分子包合体分子胶囊。因为大多数药物难溶于水，所以环糊精作为药物分子载体在临床医学上应用较广。目前，已经有大量的环糊精类药物包裹体问世，例如广谱抗菌剂甲氧苄氨嘧啶溶解度较低，且伴有苦味，这阻碍了其在临床医学应用方面的推广和研究，经β-环糊精包裹后有效地去除了苦味，改善了气味，并且溶解度显著增大。又例如α、β受体阻断剂卡维地洛(1-(9H-咔唑-4-氧基)-3-[2-(2-甲氧基苯氧基)乙基氨基]-2-丙醇)具有舒张血管的作用，可用于治疗肾功能不全、糖尿病患者的高血压等症状，但其溶解度低，严重影响了药效的发挥。卡维地洛/β-CD药物包裹体溶解度大幅增加，从而药效显著提高。

传统研究药物包裹或释放过程的方法主要采用紫外-可见分光光度法和荧光分光光度法。但上述方法灵敏度低，检测分析中易受光散射等因素的影响，只能在宏观层面上研究药物的包裹或释放，分析速度慢，药物包裹体的制备、表征以及药物释放动力学的研究所需时间较长，不能对环糊精和药物分子同时进行原位实时分析，检测范围小，受限于药物分子的光学吸收特征，因此急需发展一种单分子水平的检测手段。

发明内容

本发明的目的是提供一种检测灵敏度高，并可对药物分子同时进行原位实时分析的检测药物包裹或释放过程的单分子分析方法，可动态仿真模拟药物在体内的释放机理和作用机制。

本发明的实现过程如下：

一种检测药物包裹或释放过程的单分子分析方法，包括以下步骤：

（1）在电解池顺式加入α-溶血素蛋白质双突变体(M113F/K147N)₇，双突变体(M113F/K147N)₇插于脂双层形成蛋白质纳米单通道；

（2）在电解池反式依次加入环糊精和药物分子，记录加入药物分子前后单通道电流的变化，当在环糊精造成的电流阻塞基础上出现二次电流阻塞水平台即证明药物包裹体的形成，电流变化呈三态P-Drug、P-βCD和P-βCD-Drug。

一种检测药物包裹或释放过程的单分子分析方法，包括以下步骤：

（1）在电解池顺式加入α-溶血素蛋白质双突变体(M113F/K147N)₇，双突变体(M113F/K147N)₇插于脂双层形成蛋白质纳米单通道；

（2）在电解池反式加入环糊精药物包裹体，记录蛋白质纳米单通道电流的变化，当环糊精药物包裹体释放的自由药物分子和环糊精分子在蛋白质纳米单通道内发生单分子键合再次形成环糊精药物包裹体时，单通道电流出现二次电流阻塞水平台即证明药物包裹体的再次形成，电流变化呈三态P-Drug、P-βCD和P-βCD-Drug。

根据上述方法，可将天然α-溶血素蛋白质双突变体(M113F/K147N)₇用于药物分子包裹或释放过程的原位动力学过程分析以及用于药物分子包裹或释放过程机理研究，所述的药物分子包括合成药物或天然药物、气味剂、食品添加剂或化妆品成份。

天然α-溶血素纳米通道传感器对环糊精分子以及奥美拉唑和盐酸阿霉素等无响应或响应很弱，为此本发明设计并制备了113位和147位的双突变体(M113F/K147N)₇纳米通道传感器(蛋氨酸M突变为苯丙氨酸F，赖氨酸K突变为天冬氨酸N，见图1)。双突变不仅可极大地增强环糊精分子在纳米通道中的键合和药物分子在纳米通道中的直接键合，且允许自由药物分子、β环糊精分子和药物/环糊精复合物的同时检测，可方便地实现单分子水平药物包裹和释放过程的动力学研究。 

本发明的创新点和积极效果为：

（1）本发明检测环糊精/药物体系的方法是单分子方法，与现有基于宏观层面分子聚集行为的药物检测方法(如紫外-可见分光光度法，荧光分光光度法等)不同，具有很高的检测灵敏度；

（2）本发明可同时检测环糊精载体和药物分子二者及其动态变化，这是其它技术很难达到的；