[发明专利]一种金属络合物用作自噬溶酶体标记物

说明书

技术领域

本发明涉及生物检测试剂领域，是一种用于检测自噬溶酶体的标记物。 

背景技术

本发明涉及一种由有机化合物配体与金属离子组成的络合物及其作为自噬溶酶体标记物。此发明制得的金属化合物可作为自噬溶酶体标记物，用于检测自噬过程，特别是关于溶酶体疾病，例如检测和监测溶酶体累积疾病进程、监测药物效果或用于治疗疾病；此发明也是关于毒性筛选方法，特别是对于潜在药物和可疑有毒物质的方法和高通量筛选；也可以用于基于荧光显微镜，共聚焦显微镜的实验和组织成像。 

细胞自噬是哺乳动物细胞溶酶体降解的主要途径，对维持细胞的自我平衡、发展和能量平衡非常重要。细胞自噬过程的中断与神经退化性紊乱、癌症、心脏病和感染等疾病密切相关。通过研究细胞自噬及其复杂的分子诱导机制，探索自噬在细胞发生、发展中发挥的作用，为疾病治疗提供了新的途径。通过调节细胞自噬活性的治疗已经成为当代肿瘤治疗和帕金森等疾病治疗领域的新靶点和研究热点。无论科研单位还是制药公司对药物诱导细胞自噬在疾病治疗中的应用表现出极大兴趣，期望通过研究自噬和死亡的关系和分子机理，进而利用细胞自噬的调节作用，使其在疾病治疗中发挥作用。 

基于细胞的检测由于它们的高生理的相关性，在制药工业中越来越受欢迎。其它优点包括他们预测化合物的用途的能力，评估分子相互作用，确定毒性，区分细胞类型与特异性药物效果，并确定药物渗透。基于细胞的实验是始终相关的药物发现渠道，因为它们能够提供从目标特性到毒理学终端阶段的数据。当前行业发展趋势要求，使用细胞实验进行药物筛选时容易进行监测，且能够非侵入性的报道数据。对新药开发而言，其根本途径是提高效率，降低成本，在更短的时间上市场。为早期阶段失败的化合物提供丰富的信息和准确的数据对早期阶段的决策是必需的。这些数据可能会来自筛选化合物的结果中，即筛选相关的生态系统，而不是经典生化分析。这些筛选系统通常整合在先进的成像平台，如高通量筛选（HCS）工作站。产业化荧光显微镜将导致高通量HCS影像平台的发展。当加上荧光报告技术，HCS提供了信息丰富的药物筛选，以及新类型的药物靶标。因此，开发一种快速有效的自噬探针对于监测细胞自噬过程和诊断相关疾病是非常必要的。 

荧光标记的抗体虽然适用于分析细胞表面和透化细胞，但因为它们难以透过细胞，所以很少用于活细胞。近年来，发展可透过细胞的小分子荧光标记物逐渐兴起。可接受的用于细胞成像和分析的小分子荧光标记物需要最低限度的干扰，通用、稳定、易于使用、非破坏性的成像设备检测。从组织学的角度来看传统标记物的一个问题是需要辅助因子或需要固定或染色，仅在静态的死细胞条件下给出结果。操作所需的额外的步骤可能是耗时和昂贵的，并且在固定和染色的情况下缺乏生物学相关性。从分析来看，标记物应该能够在活细胞中能够实时反应实验结果。而对于药物筛选而言，简单易用是关键。 

虽然过往已有各种荧光标记物被报道用于活细胞分析，例如JC-1染料可以动态的监控线粒体膜电位的变化，但对于自噬溶酶体还缺乏满意的标记物用于跟踪细胞内细胞器的动态变化以及相关的药物筛选。目前广泛使用的自噬标记物是GFP-LC3，它是一种GFP蛋白和LC3标记物的融合物。GFP-LC3作为自噬溶酶体荧光标记物，在自噬作用初期是非常有效的。但由于其信号会随着降解和酸度影响而逐渐减弱，所以无法用于自噬作用后期和较长的时间段。而且，GFP-LC3存在聚合的问题，容易给出错误的信号。尽管目前也有一些关于监测自噬作用后期的荧光标记物的报道，但都不禁理想。 

对研究细胞内的靶向分子与作用区域的相互作用，荧光合作局域化成像是一个功能强大的方法。在这些实验中，不同的荧光物和发光蛋白在特定的检测通道成像。从每个发光物给出的空间和浓度信息在每个通道中都可自由控制。现有的很多用于亚细胞分析的标记物都无法满足这类要求。 

发明内容

本发明提供一种高效的荧光标记物，专用于检测自噬作用后期和阳离子诱导的自噬作用。这种标记物是一种小分子化合物，它不同于LC3这种大分子蛋白，不存在聚合问题。它不受酸度影响，在检测活体细胞和固定细胞时均能给出高灵敏的信号。而且，此标记物可以被高穿透性的近红外和长波长激发，对于监测细胞非常重要。 

本发明还提供一种基于此标记物的自噬溶酶体检测的方法，包括以下步骤：1）获得样品细胞；2）连接标记物到细胞的自噬溶酶体；3）通过检测标记物以监测细胞自噬。此方法可以运用在如下领域：1）实时监测细胞自噬过程；2）检测与自噬溶酶体相关的药物的作用效果；3）药物筛选。