[发明专利]Survivin启动子介导的表达植物毒素Gelonin基因的重组载体及其用途

说明书

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及Survivin启动子介导的表达植物毒素Gelonin基因的重组载体及其用途。

背景技术

肝癌是一种严重威胁人类健康的恶性肿瘤[1]。根据最新统计，全世界每年约有六十万新发肝癌患者[2]，并呈逐年增长趋势。肝癌位居死亡相关癌症排名的第三位[1]。通常被确诊为肝癌晚期的患者平均生存期小于3个月，五年生存率仅有10%左右[3-5]。因此，寻找有效地治疗策略和方法是科研工作者们面临的艰巨而又迫切的问题。直到现在，研究者们仍未发现有非常理想的手段治疗肝癌。

之前研究表明，毒素能够应用于癌症的治疗研究[6-10]。Gelonin植物毒素是一种来源于东亚热带森林中大戟科植物Gelonium multiflorum种子中的蛋白质，其属于核糖体失活蛋白（Ribosome-inactivating proteins,RIPs），可催化真核生物核糖体中60S亚单位28S核糖体核糖核酸（rRNA）的4324位腺嘌呤碱基不可逆失活，从而阻断蛋白质的合成。植物毒素gelonin具有高稳定性和低毒性，并且不易引起毛细血管渗漏综合症等副作用的产生，已被应用于肿瘤的治疗研究中[11,12]。含gelonin的重组蛋白已被应用于肿瘤的治疗研究[13-15]。将毒素与其他生长因子或单链抗体融合，组成的免疫毒素能够很好的靶向实体瘤、肿瘤血管或恶性血液癌，并展现出对靶细胞很高的选择性和很好的特异性，是较好的临床药物候选者[13]。抗EGFR单链抗体融合gelonin免疫毒素能够抑制EGFR表达阳性的肿瘤细胞增殖，能够较好的抑制非小细胞肺癌的生长，具有良好的抗肿瘤活性[12]。毒素药物在治疗中易引起机体免疫原性和非肿瘤组织毒性，并容易诱发血管渗漏综合征产生。并且有较差的实体肿瘤渗透性。这些问题在很大程度上限制了免疫毒素在临床治疗中的应用[16-18]。

理想的基因治疗需要有精确的靶向性和较好的安全性[19]。近年来，研究的基因靶向策略主要针对于基因转移水平，基因转录水平，和表达水平的靶向[20]。其中，介导治疗基因在特定组织特异性表达，已经成为一种新的癌症治疗策略，并被广泛应用。该策略往往选用细胞特异性的启动子插入到靶基因的上游，调节治疗基因在特定组织或细胞中表达，达到治疗的目的。其中，治疗基因通常选用的是致死基因[21]，细胞因子[22]，毒素[23]等。可是到目前为止，在毒素基因治疗中，国内外有关植物毒素的报道却比较少。在基因治疗中，如果能够将植物毒素gelonin基因有针对性的表达的话，治疗肝癌的效果将是可观的[24,25]。为了使植物毒素gelonin能够在癌症细胞中特异性表达，一种较好的方法无外乎选择一个较好的癌症特异性启动子以限制治疗基因的无选择性表达[26,27]。在基因治疗中，选择的启动子需要有较好的特异性。目前，一些启动子已被较好的应用于癌症基因治疗，并取得了较好的治疗效果[28,29]。

Survivin蛋白是凋亡抑制家族新成员。Survivin蛋白过表达于多种肿瘤细胞中，但在正常成年人组织中几乎不表达[30-32]。据统计，发现约有70%的肝癌患者癌症组织中survivin蛋白呈较高表达。并且，癌旁组织survivin蛋白表达量很低，与癌组织中蛋白表达量差异很大[33-34]。Survivin基因上游2560-2920bp是survivin基因启动子，能够介导启动survivin基因的表达。survivin启动子优越于其他的启动子，是因为它在大多数正常组织中展现出非常低的活性[35]。survivin启动子介导的靶向治疗已经广泛应用于乳腺癌[36]、肺癌[37,38]、胃癌[39]和胶质瘤[40]。这些研究表明，survivin启动子能够用于肿瘤靶向的治疗研究[36]。

发明内容

本发明的主要目的是寻找一种更安全有效的植物毒素治疗肝癌的方法。

本发明的技术方案是基因表达框架，由Survivin启动子可操作的连接植物毒素Gelonin基因构成。

进一步的，所述的基因表达框架的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。

本发明还提供了Survivin启动子介导下表达植物毒素Gelonin基因的重组载体。

进一步的，所述的重组载体的Survivin启动子的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。

进一步的，所述的重组载体的植物毒素Gelonin蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID No.3所示。

进一步的，所述的表达植物毒素Gelonin基因的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示。