[发明专利]豚鼠切齿中DSPP基因的实时荧光定量PCR的检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种荧光定量PCR的检测方法，具体说是一种豚鼠切齿中DSPP基因的实时荧光定量PCR的检测方法。

背景技术

牙本质涎磷蛋白基因（Dentin Sialophosphoprotein，DSPP）编码牙本质涎蛋白（Dentin sialoprotein，DSP）和牙本质磷蛋白（Dentin phosphoprotein，DPP）两个蛋白质。二者是同一个转录本的表达产物经切割产生的大小不同、生物学作用各异的两个片段。DPP和DSP作为成牙本质细胞分泌的重要的非胶原蛋白，它们参与上皮间充质相互作用，促进成牙本质细胞定向分化，并通过启动晶体成核，调节晶体形态和生长速度，对抗蛋白水解酶的降解功能等，从而保证牙本质基质钙化。DSP是一种糖蛋白，约占牙本质非胶原蛋白总量的5%～8%，在前期牙本质向牙本质的转化过程中起着重要作用。DPP是牙齿中最主要的非胶原蛋白，约占牙本质所有非胶原有机成分的50%，在成牙本质细胞中特异表达；一般认为DPP定位于原胶原分子间，DPP富含天冬氨酸和丝氨酸，具有高度重复的Asp-Ser-Ser模体，作为羟基磷灰石晶核，参与牙齿矿化。DSPP突变可导致该基因编码蛋白功能残缺，使得牙齿矿化受到影响，牙本质发育不全。定量检测DSPP基因的表达对牙本质发育不全具有重要的临床诊断意义。

豚鼠切齿具有执行切断食物的功能，组织异常坚硬，细胞含量极少，有机物成分含量不足20%，核酸丰度值低，核酸提取较为困难。目前尚未见有豚鼠切齿中DSPP基因的实时荧光定量PCR检测方法的报道。

发明内容

本发明的目的在于克服豚鼠切齿组织异常坚硬、核酸丰度值较低、细胞含量极少，有机物成分含量低等困难，提供一种豚鼠切齿中

DSPP基因的实时荧光定量PCR的检测方法，它操作简单，可进行批量检测。 

本检测方法由如下步骤组成：

A、样本的准备：快速拔取牙齿，除净附着的牙龈组织，以4℃灭菌生理盐水反复冲洗，用灭菌滤纸吸干，迅速将牙齿用灭菌咬骨钳截成小块，放入液氮中进行低温冷冻脆化处理24～48 h；

B、设计引物：根据Genbank中豚鼠的β-actin基因和大鼠的DSPP基因的mRNA序列设计相应的引物，

β-actin基因扩增时使用的引物为：

上游引物：5’-AGCAGATGTGGATCAGCAAG-3’

下游引物：5’-AAGGGTGTAACGCAGCAAAG-3’

DSPP基因扩增时使用的引物为：

上游引物：5’-GTTAGTGCCGCTGGAGAGAG-3’

下游引物：5’-ATCGTCGTTAGTGGCGTTG-3’

C、提取总RNA：从液氮中取牙齿小块150～200 mg，进行液氮研磨，一般研磨14～16 min；收集研磨好的牙齿组织粉末，加入到预先加有1 ml裂解液的预冷5 ml离心管中，在冰浴下以转速3000 r/min进行间歇性匀浆2～3 min；转入2.0 ml的离心管中，25℃温浴静置5 min；加入0.2ml氯仿，在旋涡振荡器上旋涡振荡15 s，25℃温浴静置3 min；在4℃下以12000 g离心15 min；收集上清，加入0.5 ml异丙醇，25℃温浴静置10 min；在4℃下以12000 g离心10 min；弃去上层悬液，加入1 ml 75%乙醇溶液，旋涡振荡洗脱，在4℃下以7500 g离心5 min；弃上清，干燥RNA沉淀5～10 min，加入10 μl的0.1%DEPC处理水，于55～60℃下进行加热10 min，分装后保存于－80℃；

D、反应体系的建立：RT-PCR反应体系组成包括：总RNA模板、上下游引物、Buffer、反转录酶、荧光染料；建立20 μl的反应体系；

E、反应条件的优化：参照引物的TM值，通过扩增曲线和熔解曲线分析，确定最佳的引物浓度、退火温度和时间以及总RNA模板添加量；本发明采用的反应条件为：95℃预变性10 s，95℃变性5 s，58℃退火20 s，72℃延伸6 s；共40个循环；