[发明专利]一种感受态宿主细胞的制备方法以及一种快速高效将外源物质转入宿主细胞的方法及其应用

说明书

技术领域

本发明属于生物产品和生物技术应用领域，具体涉及将外源物质转入宿主细胞的方法。

背景技术

在生物技术领域，基因横向转移，是指生物将遗传物质水平传递给其他细胞而非垂直传递给其子代的过程，是目前研究外源基因功能的重要手段，特别是在微生物水平(如病毒、细菌、真菌、植物细胞、动物细胞等)非常常见，一种细菌往往通过从其他细菌获得部分遗传物质从而获得新的性状，例如目前大量使用抗生素之后导致编码可分解抗生素的基因在不同细菌之间横向扩散，从而形成耐药菌。而在实验室中，则往往利用这种遗传物质可在不同个体之间进行传播和扩散的性质研究外源DNA以及其他生物活性物质的功能。然而，包括细菌、真菌（如酵母）、植物细胞、动物细胞等在内的细胞通常具有细胞膜，严格限制外源物质的进入，因此，如何将这些细胞通过一定的技术处理将其改变为能够接受外源物质的状态即感受态，是生物工程和生物技术领域的一个重要研究内容。

目前常用的可促进将外源物质转化宿主细胞的方法主要有：利用二价金属离子（如钙离子）在一定温度条件（如42℃）下，会使宿主细胞由于热刺激而导致细胞膜通透性变大，从而易于摄入外源物质（如DNA）（梅运军,陈向东,谢志雄等.Ca~（2＋）对诱导大肠杆菌摄取外源DNA的影响.武汉大学学报：理学版,2012,58(4):354-358.），或者采用高压电场促使宿主细胞膜瞬间穿孔等方法（张洋,王志强,刘斌等.DH10B菌株高效电转化条件探究.生物工程学报,2007,23(2):347-351.）。但这些方法均存在操作复杂、对细胞损伤大、操作成本高、转化效率低等缺点。如何建立一种快速高效的将外源物质转化（转入）宿主细胞的方法是目前生物工程和生物技术领域研究的重点问题之一。

发明内容

基于以上问题，本发明目的在于提供一种快速高效的感受态宿主细胞的制备方法，以及一种将外源物质转入宿主细胞的方法。

本发明所提供的感受态宿主细胞的制备方法，包括以下步骤：

1）纯化、复苏及预处理宿主细胞；

2）真空冷冻干燥技术处理宿主细胞，得到感受态宿主细胞。

本发明所提供的将外源物质转入宿主细胞的方法，进一步包括以下步骤：

3）制备待转入的外源物质的水溶液；

4）对步骤2）得到的感受态宿主细胞进行快速复水而将外源物质转入宿主细胞，并用条件培养基筛选已转化有外源物质的宿主细胞，得到外源物质转化菌。

在上述方法中，所述步骤1）中的宿主细胞可为任意一种原核或真核宿主细胞，如细菌细胞、真菌细胞、植物细胞和动物细胞等。由于细菌（最常用的是大肠杆菌）和酵母具有遗传背景清楚、目标基因表达水平高、表达系统成熟完善、易于培养、成本低等优点，本发明实施例中使用了大肠杆菌和酵母。

所述纯化宿主细胞是指将原宿主细胞在固体培养基表面划线培养，得到单克隆；复苏宿主细胞是指将纯化的宿主细胞重新培养一定时间，使其从静止状态重新进入到生长状态；预处理宿主细胞是指将复苏的宿主细胞扩大培养至相应浓度。具体而言，所述步骤1）纯化、复苏及预处理宿主细胞的过程如下：

（1）纯化宿主细胞：用接种环挑取原始宿主细胞，分区划线接种于适用于培养宿主细胞的固体培养基（LB固体培养基（适合大肠杆菌）配方：胰蛋白胨10g/L，酵母膏5g/L，NaCl10g/L，琼脂粉15g/L；YPD固体培养基（适合酵母）配方：酵母膏10g/L，蛋白胨20g/L，葡萄糖20g/L，琼脂粉20g/L），在适宜条件下（大肠杆菌37℃，12～16h；酵母培养30℃，48h）培养，得到宿主细胞单克隆；

（2）复苏宿主细胞：挑取宿主细胞单克隆接种到5mL适用于宿主细胞的液体培养基（LB培养基（适合大肠杆菌）配方：胰蛋白胨10g/L，酵母膏5g/L，NaCl10g/L；YPD培养基（适合酵母）配方：酵母膏10g/L，蛋白胨20g/L，葡萄糖20g/L）中，在适宜温度下（大肠杆菌37℃；酵母培养30℃）220rpm复苏过夜（12～16小时）；

（3）预处理宿主细胞：将经复苏的宿主细胞按照体积比1:100的比例接种到100mL新鲜的液体培养基（LB培养基（适合大肠杆菌）配方：胰蛋白胨10g/L，酵母膏5g/L，NaCl10g/L；YPD培养基（适合酵母）配方：酵母膏10g/L，蛋白胨20g/L，葡萄糖20g/L）中，在适宜温度下（大肠杆菌37℃；酵母培养30℃）220rpm摇菌至OD₆₀₀=0.6～1.0；吸取500μｌ菌液分装至1.5mL EP管中，-80℃冰箱预冷冻12～24小时以上。