[发明专利]一种阳离子化修饰的超氧化物歧化酶及其应用

说明书

技术领域

本发明属基因工程领域，涉及一种阳离子化修饰的超氧化物歧化酶，具体涉及基因工程重组表达方法制备的阳离子化超氧化物歧化酶。本发明还涉及该阳离子化修饰的超氧化物歧化酶在个人护理组合物中的应用。

背景技术

从20世纪70年代后，酶蛋白在个人护理产品中的应用已广泛开展。其中自由基清除相关的氧化还原酶在临床应用中被认为是对抗疾病和衰老的钥匙。超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，简称SOD）是广泛存在于生物体内能清除超氧阴离子自由基的一类金属酶，包括Cu/Zn-SOD、Mn-SOD、Ni-SOD、Fe-SOD，以二聚体或四聚体存在，单体分子量通常为20-25kD。超氧化物歧化酶已列入我国化妆品原料目录，可以作为抗衰老、消炎、美白祛斑、防晒以及抑制脱发的生物活性添加物。但由于天然超氧化物歧化酶蛋白不易透过细胞膜吸收，减弱了其使用效果并限制了其应用的范围。

人体细胞生物膜通常呈负电状态，阳离子化的蛋白衍生物或化妆品原料被认为有更好地吸附和调理作用。例如，头发所附带的静电及组成头发角蛋白的氨基酸分子和阳离子之间存在着静电吸附，阳离子型调理剂的调理作用就是通过静电吸附实现。再者，阳离子化修饰的酶蛋白被证明在生物体内更稳定、半衰期更长，可提高其生物利用效率（Journal of drug targeting，1994,2:317-321）。现有研究中酶蛋白的阳离子化修饰主要通过化学修饰实现，即通过酰胺化法屏蔽蛋白表面酸性氨基酸位点，从而提高酶蛋白的等电点，使其在体内pH条件下呈阳离子状态。例如，以二亚胺（EDC）为催化剂，以酶蛋白中的羧基与亲核反应试剂二甲基丙二胺（DMPA）的胺基进行酰化反应，以胺基阳离子基团代替羧基阴离子基团，进行阳离子化修饰。相似方法还有以二亚胺为催化剂以己二胺做亲核试剂，与酶蛋白表面的丝氨酸羟基反应，进行酶蛋白的阳离子化修饰（Journal of controlled release，2006,111:204-211）。化学修饰方法修饰产物中有大量化学试剂残留，如果采用透析等酶蛋白纯化工艺则步骤繁琐，通常会大大提高酶制剂的成本。辣根过氧化物酶阳离子化则是通过偶联聚赖氨酸，即辣根过氧化物酶特异的糖羟基被NaIO₄氧化生成醛基，而后与聚赖氨酸在pH9.5进行缩合反应偶联生成阳离子化辣根过氧化物酶。此法只适用于辣根过氧化物酶等糖蛋白。为克服上述化学修饰法制备阳离子化修饰酶的弊端，在偶联聚赖氨酸的阳离子化修饰方法的启发下，本发明通过基因重组的方法将聚赖氨酸连接到超氧化物歧化酶上，改变其等电点，利用酶蛋白在低于其等电点的溶液中带正电的性质，实现用于皮肤护理产品的酶蛋白的阳离子化修饰。

本发明现有技术及一般知识：阳离子化有利于酶蛋白在皮肤表面的吸附及吸收，以及延长在组织细胞中的半衰期。增加碱性氨基酸比例能够提高酶蛋白的等电点，酶蛋白等电点在8.5以上，在体内呈阳离子化状态，在pH4-8的皮肤护理品配方中也呈阳离子状态，可实现酶蛋白的阳离子化修饰功效。

发明内容

本发明的目的在于提供一种阳离子化修饰的超氧化物歧化酶，本发明的另一目的是提供含所述阳离子化修饰超氧化物歧化酶的皮肤护理组合物。

本发明通过以下技术方案实现：一种阳离子化修饰的超氧化物歧化酶，将等电点pI大于或等于pH5.0，单体分子量为15-25kD的超氧化物歧化酶作为亲本酶，在所述亲本酶基因序列的末端共添加10-20个赖氨酸密码子DNA序列，所述阳离子化修饰的超氧化物歧化酶的等电点大于或等于pH8.5。

本发明所述亲本酶的等电点大于或等于pH6.0。

本发明所述赖氨酸密码子DNA序列是赖氨酸常用密码子的组合。

本发明所述赖氨酸密码子DNA序列为：AAGAAAAAGA AAAAG。

本发明所述赖氨酸密码子DNA序列为：AAAAAAAAGA AGAAA。

本发明所述赖氨酸密码子DNA序列添加在引物序列上。

本发明所述赖氨酸密码子DNA序列为：AAAAAGAAAA AGAAAAAGAA AAAGAAAAAG AAGAAAAAGA AAAAG。

本发明所述赖氨酸密码子DNA序列为：AAGAAAAAGA AAAAGAAAAA GAAAAAGAAA AAGAAAAAGA AAAAGAAAAA GAAAAAGAAA。

本发明所述赖氨酸密码子DNA序列通过基因合成直接添加。

本发明所述阳离子化修饰的超氧化物歧化酶在皮肤护理组合物中的应用。