[发明专利]鸡RBP4基因单核苷酸多态性检测方法、引物与分子遗传标记

说明书

技术领域

本发明涉及鸡血浆视黄醇结合蛋白4(RBP4)基因单核苷酸多态性筛选及其与产蛋性状关联分析，尤其是鸡血浆视黄醇结合蛋白4(RBP4)基因单核苷酸多态性检测方法及其引物。

背景技术

单核苷酸多态性(singlenucleotidepolymorphisms,SNPs)，主要是指由基因组核苷酸水平上的变异引起的DNA序列多态性，包括单碱基的转换、颠换，以及单碱基的插入/缺失等。SNPs具有以下特点：(1)数量多、覆盖密度大，据估计平均每1000bp就会出现一个。目前已检测出93%的人类基因包含SNPs，98%的SNPs其距离不超过5kb，因此，可以在几乎每个基因的内部或附近提供一系列标记；(2)由于SNPs一般只有2个等位基因，在检测时只需要通过一个简单的“+/-”方式即可进行基因分型，这使得检测、分析易于实现自动化；(3)遗传稳定性强，与微卫星等重复序列多态性标记相比，SNPs具有更高的遗传稳定性；(4)多态性丰富，SNPs包含了目前已知DNA多态性的80%以上，是最常见的遗传变异类型。基于单核苷酸多态性的上述优点，研究SNP有助于解释不同个体表型性状的差异，不同群体和个体对疾病、环境因子等反应的差异。

目前对SNP进行检测的方法较多，而大多数实验室采用的是成本相对较低、技术易掌握、检出率较高、快捷、安全和步骤简单的PCR-SSCP技术。该方法原理是:经PCR扩增的目的片段在变性剂或低离子浓度下经高温处理使之解链并确保成为DNA单链，然后在一定浓度的非变性聚丙烯酰胺凝胶中电泳。在不含变性剂的中性聚丙烯酰胺凝胶中电泳时，DNA单链的迁移率除与DNA链的长短有关外，更主要的是取决于DNA单链所形成的构象。在非变性条件下，DNA单链可自身折叠形成具有一定空间结构的构象，这种构象由DNA单链碱基决定，其稳定性靠分子内局部顺序的相互作用(主要为氢键)来维持。相同长度的DNA单链其顺序不同，甚至单个碱基不同，所形成的构象不同，电泳迁移率也不同，PCR产物变性后，单链产物经中性聚丙烯酰胺凝胶电泳，因靶DNA中发生单碱基置换，或个别碱基插入或缺失时，因迁移产生变化会出现泳动变位，从而可将变异DNA与正常DNA区分开。相同长度的单链DNA因其顺序不同或单个碱基差异，所形成的构象就会不同，其在凝胶中泳动速度不一样，从而显示出带型的差异，即多态型。

SNP有非同义cSNP、同义cSNP、内含子区SNP、调控区的rSNP几类，均能从不同角度影响基因功能，其中非同义cSNP由于改变基因编码的氨基酸，从而影响基因功能；同义cSNP可通过改变mRNA的二级结构、翻译速度等影响基因功能的发挥；内含子区SNP可通过改变剪接位点的活性来影响基因功能；调控区的rSNP则可通过影响启动子元件来调节基因的功能。

血浆视黄醇结合蛋白(RBP)属于疏水性分子结合蛋白家族,是血液中结合、运送全反式视黄醇及视黄酸、视黄醛等到靶组织的重要的转运蛋白，参与动物上皮、骨组织的生长、分化与繁殖（精母细胞分化、精子形成、受精、胚胎附植、胚胎发育）。RBP4是血浆视黄醇结合蛋白(RBP)家族成员之一。Wendler等报道,RBP4基因影响小鼠心脏的发育,RBP4基因敲除的小鼠在胚胎发育的前9d表现为心脏小梁发育延迟,在12.5d的心流出通道中有过多的纤维结合素蛋白沉积。对狒狒等动物RBP4基因mRNA表达的研究显示，在不同动物，即使是同种动物的不同组织，时空表达模式都有差异。目前对RBP4基因发育性表达的研究主要集中在哺乳动物发情期和妊娠时期mRNA水平的监测。Harney等在猪上研究表明，在猪发情期第0.5和10d，妊娠第10d时，RBP4基因的表达水平都很低，但是从第10d开始一直到15d，RBP4基因mRNA的表达量都在上升，发情期第18d开始下降，但是妊娠期子宫内膜中的表达量保持上升趋势。MacKenzie等对牛发情期和妊娠期子宫内膜和腺体上皮细胞中RBP4基因mRNA表达研究发现，发情第1d表达水平中等，持续到第5d，然后开始下降，15d后开始回升，到20d时达到峰值。妊娠情况与发情类似，第17-20d倍增，直到22d保持该水平不变，此后又有所增加。因此研究RBP4基因遗传变异和分子遗传特征对动物生长发育、繁殖具有重要理论意义和实践意义。

迄今为止，国内外均未见鸡RBP4基因遗传变异的研究，由于中国地方鸡种血浆视黄醇结合蛋白(RBP)遗传变异领域的研究匮乏，该基因位点的功能研究及其遗传变异与产蛋性状（如产蛋量、开产体重、开产蛋重等）关联的研究仍是空白。

发明内容