[发明专利]鸡传染性支气管炎N-2-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖/羧甲基壳聚糖纳米活苗的制备方法

权利要求书

1.鸡传染性支气管炎N-2-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖/羧甲基壳聚糖纳米活苗的制备方法，其特征在于鸡传染性支气管炎N-2-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖/羧甲基壳聚糖纳米活苗的制备方法按以下的实验步骤实现：

一、取50～400μl IBV H120系病毒液加入无菌去离子水补足至2mL，然后加入到5mL浓度为0.5～2.0mg/mL的过滤除菌后的N-2-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖溶液中，然后在室温、无菌条件下以搅拌速度为300r/min的条件下搅拌5min，得到混合溶液A；

二、将混合溶液A在室温、无菌条件下以900r/min～1300r/min速度搅拌1min后，然后滴加2mL浓度为0.75～1.75mg/mL的过滤除菌后的N，O-羧甲基壳聚糖溶液；然后在搅拌速度不变的条件下磁力搅拌20min～50min，得到混合溶液B；

三、将混合溶液B于4℃、12000r/min离心20min，去上清，并用温度为4℃的无菌去离子水洗涤沉淀3遍，收集固相物；

四、将固相物加入到4℃的无菌去离子水中，再加入质量浓度为5％的蔗糖脱脂乳溶液，真空冷冻干燥24h，得到鸡传染性支气管炎N-2-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖/羧甲基壳聚糖纳米活苗，即完成鸡传染性支气管炎N-2-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖/羧甲基壳聚糖纳米活苗的制备方法；其中步骤一中IBV H120系病毒液为经过浓缩纯化后的鸡传染性支气管炎H120系病毒液，病毒含量为10^6.5EID₅₀/0.1mL；步骤四中4℃的无菌去离子水与质量浓度为5％的蔗糖脱脂乳溶液的体积比为1∶1。

2.根据权利要求1所述的鸡传染性支气管炎N-2-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖/羧甲基壳聚糖纳米活苗，其特征在于步骤一和步骤二所述的过滤除菌的方法为：在无菌操作台中通过0.22μm的细菌滤器进行过滤。

3.根据权利要求1所述的鸡传染性支气管炎N-2-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖/羧甲基壳聚糖纳米活苗，其特征在于步骤一中所述的取200μl病毒液并加入无菌去离子水补足至2mL，然后加入到5mL浓度为1.0mg/mL的过滤除菌后的N-2-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖溶液中。

4.根据权利要求1所述的鸡传染性支气管炎N-2-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖/羧甲基壳聚糖纳米活苗，其特征在于步骤二中所述的将混合溶液A在室温、无菌条件下以1200r/min搅拌1min后，然后滴加2mL浓度为0.8mg/mL的过滤除菌后的N，O-羧甲基壳聚糖溶液。

5.根据权利要求1所述的鸡传染性支气管炎N-2-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖/羧甲基壳聚糖纳米活苗，其特征在于步骤二中所述的N，O-羧甲基壳聚糖的合成方法按以下步骤实现：

一、将5g粉末状壳聚糖置于250mL三口烧瓶中，加入40mL异丙醇并搅拌，浸泡1-12h后加入60mL浓度为10-40mol/L的NaOH溶液，搅匀后浸泡2～24h，得碱化壳聚糖；

二、将20g氯乙酸水浴加热溶于10mL的异丙醇中，然后均匀分成五份，再依次在搅拌状态下加入到碱化壳聚糖中，每份间隔10min加入，然后在40～80℃下反应2～8h，制得羧甲基壳聚糖混合物，然后加入20mL蒸馏水，用体积浓度为1％的盐酸调pH至7.0，再用布氏漏斗抽滤，滤液中加入4倍量的无水乙醇充分沉淀，过滤，然后依次用体积浓度为95％的乙醇和无水乙醇洗涤，再置于30～60℃下真空干燥6～24h，得精制品，即完成N，O-羧甲基壳聚糖的合成。

6.根据权利要求1所述的鸡传染性支气管炎N-2-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖/羧甲基壳聚糖纳米活苗，其特征在于步骤二中所述的磁力搅拌时间是40min。

7.根据权利要求1所述的鸡传染性支气管炎N-2-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖/羧甲基壳聚糖纳米活苗，其特征在于步骤二中所述的过滤除菌后的N，O-羧甲基壳聚糖的滴加速度为0.007mL/s。