[发明专利]一种小麦基因组中华山新麦草外源物质的鉴定方法

说明书

技术领域

本发明属于农业技术领域，涉及一种小麦基因组中华山新麦草外源物质的鉴定方法。

背景技术

原位杂交(in situ Hybridizztion，ISH)技术是细胞学和现代分子生物学成功结合的产物，目前在外源物质鉴定上应用最为广泛，它是根据核酸分子碱基互补配对原则，将经放射性或非放射性物质标记的外源核酸探针与染色体制片上的特异染色体进行杂交，并对杂交信号放大，通过放射自显影或其它检测系统进行检测，以确定某物种的异源染色体或其片段的技术。具体方法包括：1染色体制片，2探针和封阻DNA制备，3DNA的检测，4DNA的剪切，5缺口平移法地高辛标记DNA程序，6染色体制片的变性，7杂交洗脱荧光信号的检测，8复染和封片。原位杂交虽能清楚而准确的鉴定小麦背景中外源染色体及其片段，但不能具体区分导入小麦背景中的外源染色体的同源群归属。而且此方法程序复杂投入较大，技术要求较高。

染色体分带技术是通过一定的碱、酸、盐、温度等因素对染色体进行处理，借助Giemsa等染料染色，使染色体在一定部位呈现深浅程度不同的染色区段而形成特定的带纹，由于其带纹在各染色体上显示的位置、宽窄、大小、数目、浓淡等具有相对的稳定性，故可用来进行染色体的鉴别和分析。具体方法包括：1染色体制片，2染色体预处理，3Giemsa等染料染色，4洗脱，5封片观察。染色体分带根据其带纹的不同可区分外源染色体，分辨同源群关系，但多数实验表明染色体分带带纹模糊且易丢失，对于不同物种不同染料，染色强弱，温度，时间不易把握，且染色体制片技术要求较高。

同工酶是结构不同但功能相同的一类酶。在一定条件下电泳染色，同一遗传材料可同时显示几条酶带，而不同的遗传材料可具有不同的酶带。同工酶是基因的直接产物，是基因表达的结果。具体方法包括：1取样，2配制酶提取液，3研磨离心，4电泳。研究同工酶表达有利于探明外源基因向栽培小麦转移的过程。随着电泳技术的提高，小麦7个部分同源群染色体长、短臂的特异性生化标记-同工酶位点已确定。但此技术不易操作，酶提取程序繁琐，不同的酶在植株不同部位及发育时期含量都不同。

比较而言，SCAR标记技术是一种快速便捷的鉴定小麦背景中外源遗传物质的方法，为高效筛选外源种质提供了可靠保障，从而提高了外源种质的利用效率。

发明内容

为了解决上述技术问题，本发明提供了一种小麦基因组中华山新麦草外源物质的鉴定方法，本发明利用RAPD引物进行华山新麦草特异序列筛选；将特异条带回收、克隆、测序、比对及Southern分析；通过引物设计，进行华山新麦草SCAR标记的转化，并利用小麦近源种属基因组DNA对SCAR标记进行特异性检测；最终用于鉴定小麦-华山新麦草全套异附加系及未确定同源群关系的异附加系中华山新麦草整条染色体。该方法为充分利用华山新麦草种质资源，简化小麦基因组中华山新麦草外源物质的鉴定方法，提高外源种质资源的利用效率提供了可靠保障，本发明所述方法简便易行，适合推广应用。

其技术方案如下：

一种小麦基因组中华山新麦草外源物质的鉴定方法，包括以下步骤：

1)华山新麦草RAPD特异序列筛选及特异片段回收

以华山新麦草和各种小麦近缘种属基因组DNA为模板，利用RAPD10碱基随机引物共500条进行PCR扩增，筛选华山新麦草特异多态性条带并回收该条带。

2)华山新麦草RAPD特异序列的克隆

根据T-A克隆法，将回收产物连接、克隆到pMD19-T载体上，转化至DH5α感受态细胞。经蓝白斑筛选，挑取白斑转化子的阳性克隆提取质粒DNA，酶切鉴定，测序。

3)序列比对分析

将测序结果提交至NCBIGeneBank利用BLASTn和BLASTx进行序列比对。

4)Southren blotting检验序列的特异性

为进一步验证华山新麦草特异性序列，以该序列为探针，Ns，ABD，A，AB，AG，AAG，B，C，D，E，H，I，K，M，PPP，B′C′，AtG，R，S，SY，SYW，St，StPY，U，V，W，Y基因组为模板进行Southren blotting分析。

5)SCAR引物设计、验证

利用primer v5.0和oligo v6.0对华山新麦草特异性序列设计引物，以Ns，ABD，A，AB，AG，AAG，B，C，D，E，H，I，K，M，PPP，B′C′，AtG，R，S，SY，SYW，St，StPY，U，V，W，Y基因组为模板扩增验证SCAR引物的特异性。

6)SCAR标记应用