[发明专利]产丰加霉素的淀粉酶产色链霉菌工程菌、构建方法及用途

说明书

技术领域

本发明涉及利用透明颤菌血红蛋白基因在淀粉酶产色链霉菌中表达提高丰加霉素产量的方法，属于基因工程技术领域。

背景技术

　　丰加霉素是一种新型核苷类抗生素，分子式为C₁₂H₁₃N₅O₄，核糖C₁连接类似鸟嘌呤的脱氮杂嘌呤环，核心结构为吡咯嘧啶核苷类似物。作用机理主要是通过抑制微生物的转录而影响菌体的生长，其生物活性研究报道主要集中在临床医学领域。近期有研究发现丰加霉素对多种植物疫病具有良好的防治效果，长期使用不会造成环境污染，而且对植物生长也具有一定的调节作用。因此，丰加霉素在农业植物病害防治领域具有的应用潜力。相对于化学合成法，生物法合成丰加霉素以可再生资源为原料，具有反应条件温和、污染少以及成本低廉等优点，因此，生物合成法是目前丰加霉素工业化生产比较经济有效的方法。

 　　丰加霉素属于次级代谢产物，在发酵过程中菌丝结构稠密，发酵液粘稠导致溶氧水平受到限制，导致丰加霉素合成水平较低，生产能耗较大，难以规模化生产。解决该问题的现有方法一般都局限于通过通入纯氧、通气/搅拌优化配置等方式来提高细胞生长环境中的氧气传递性质，增加了生产成本。

透明颤菌血红蛋白（VHb）是目前为止研究最为透彻的原核生物血红蛋白，许多研究均表明它在细胞中处于限氧条件下促进细胞生长、提高细胞培养密度和蛋白质合成能力。抗生素的生产是一个好氧的过程，由于VHb在微氧条件下可以提高细胞的溶氧水平，促进细胞的生长以及提高次级代谢产物的产量，因此VHb在抗生素生产中受到广泛的研究和应用。安德荣等SOE-PCR (Splicing by overlap extension PCR)技术构建含红霉素抗性基因启动子PermE 和 vgb 结构基因融合片段的整合型表达载体 pJD100，利用接合转移法将vgb基因整合到瑞拉菌素产生菌委内瑞拉链霉菌秦岭变种中，使工程菌株的效价提高，但其中获得基因融合片段的过程操作复杂，易产生移码突变。陈文青等基于质粒pWQ2005中的硫链丝菌素诱导启动子PtipA启动vgb的表达，利用接合转移法将vgb基因整合到泰乐菌素的生产菌株弗氏链霉菌中，但由于PtipA启动子受到硫链丝菌素诱导，发酵过程中添加对菌体生长不利。载体pIB139是在链霉菌整合型质粒pSET152的多克隆位点加入启动子PermE*构建而成的链霉菌穿梭质粒，便于基因在链霉菌中的高效表达，同时由于其中具有用于接合转移的oriT功能区域，链霉菌筛选标记-安普抗性基因（apr），整合酶基因，链霉菌温和噬菌体ΦC31的attP位点。因此，pIB139可利用简便高效的属间接合转移法导入链霉菌，并可通过特异性重组整合在链霉菌染色体的attB位点上，随着宿主染色体的复制而复制并赋予安普抗性。赵广荣等将vgb基因置于pIB139中的PermE*下游，通过原生质体转化将其转入链霉菌中。但是其中原生质体转化操作复杂，需要原生质体的制备，原生质体转化还存在宿主的限制性修饰系统而导致转化效率较低，同时赵广荣等并未考察重组菌中vgb表达对菌株合成目的代谢产物的影响。

发明内容

  　　为了克服现有技术的不足，本发明提供了一种产丰加霉素的淀粉酶产色链霉菌工程菌、构建方法及用途。

 　　淀粉酶产色链霉菌(Streptomyces diastatochromogenes) 1628是一株拮抗放线菌，其发酵液对多种植物病原真菌具有较强的抑制作用，经分离提取，确定其主要有效成分为丰加霉素，尚未见淀粉酶产色链霉菌的遗传表达体系的研究报道。本发明以绿色荧光蛋白基因(gfp)作为报告基因，成功构建了含有permE^*启动子的淀粉酶产色链霉菌重组表达载体pIB139-gfp，对其在淀粉酶产色链霉菌中启动子活性进行研究后发现，在淀粉酶产色链霉菌中permE^*启动子可有效启动外源基因的表达。在此基础上，成功构建了携带有来源于透明颤菌血红蛋白基因vgb的表达质粒pIB139-vgb，并通过接合转移法将其整合在淀粉酶产色链霉菌1628染色体上。