[发明专利]加强了adpA表达的重组淀粉酶产色链霉菌及构建方法与用途

说明书

技术领域

本发明涉及通过加强adpA基因在淀粉酶产色链霉菌的表达提高丰加霉素产量，属于基因工程技术领域。 

背景技术

丰加霉素是一种新型核苷类抗生素，分子式为C₁₂H₁₃N₅O₄，核糖C₁连接类似鸟嘌呤的脱氮杂嘌呤环，核心结构为吡咯嘧啶核苷类似物。作用机理主要是通过抑制微生物的转录而影响菌体的生长，其生物活性研究报道主要集中在临床医学领域。近期有研究发现丰加霉素对多种植物疫病具有良好的防治效果，长期使用不会造成环境污染，而且对植物生长也具有一定的调节作用。因此，丰加霉素在农业植物病害防治领域具有的应用潜力。相对于化学合成法，生物法合成丰加霉素以可再生资源为原料，具有反应条件温和、污染少以及成本低廉等优点，因此，生物合成法是目前丰加霉素工业化生产比较经济有效的方法。 

丰加霉素属于链霉菌的次级代谢产物，合成途径复杂，受到多种因素的限制与调控，导致丰加霉素合成水平较低，难以规模化生产。解决该问题的现有办法一般都是通过传统的诱变育种作为主要手段筛选高产优质的生产菌株，但筛选到高效菌株的不确定因素多、周期长。 

随着分子生物学等技术的发展，如何利用先进技术提高次级代谢产物的产量成为研究的热点。有研究表明，adpA基因是链霉菌A-因子调控网络中的中心转录多效调控因子，参与多种生命活动，可激活很多形态分化和次级代谢产物所需基因的表达。灰色链霉菌，天蓝色链霉菌和阿维链霉菌的adpA基因均被成功克隆，研究发现adpA基因缺失株形态分化受阻，次级代谢产物合成量降低，通过基因互补可恢复突变株形态分化和次级代谢物合成能力。同时，将模式菌株天蓝色链霉菌adpA基因在其他链霉菌中的异源表达可以提高次级代谢产物的产量。但是此策略只在少数特定的菌株，及特定目标产物上成功过。对淀粉酶产色链霉菌来说，从表达体系的建立到目标产物的提高涉及到复杂的因素，目前尚无报道。 

发明内容

为了克服现有技术的不足，本发明提供了一种加强了adpA表达的重组淀粉酶产色链霉菌及构建方法与用途。 

淀粉酶产色链霉菌(Streptomyces diastatochromogenes) 1628是一株拮抗放线菌，其发酵液对多种植物病原真菌具有较强的抑制作用，经分离提取，确定其主要有效成分为丰加霉素，尚未见淀粉酶产色链霉菌的代谢工程分子改造方面的的研究报道。 

本发明首先从以淀粉酶产色链霉菌(Streptomyces diastatochromogenes)1628 (菌株的保藏编号为CGMCC NO. 2060)中克隆出中心转录多效调控因子adpA基因，并将该基因与链霉菌整合表达型质粒pIB139连接，成功构建了携带adpA基因的重组载体pIB139-adpA，并利用接合转移法将其整合在淀粉酶产色链霉菌1628染色体上。 

一种产丰加霉素的淀粉酶产色链霉菌工程菌，它的染色体上过量整合了中心转录多效调控因子adpA基因，具有比淀粉酶产色链霉菌(Streptomyces diastatochromogenes) 1628更高的丰加霉素合成能力。 

       所述的产丰加霉素的淀粉酶产色链霉菌工程菌的构建方法，过程如下： 

  1）构建表达载体pIB139-adpA； 

  2）利用接合转移法将所述的表达载体整合入淀粉酶产色链霉菌染色体，获得所述的工程菌。

　　所述的方法，利用pIB139载体上的启动子permE*启动adpA基因的表达，利用接合转移法将载体pIB139-adpA特异性的整合入淀粉酶产色链霉菌(Streptomyces diastatochromogenes) 1628的染色体，获得了遗传稳定的工程菌。 

　　所述的淀粉酶产色链霉菌工程菌生产丰加霉素的用途，重组菌丰加霉素合成途径的关键酶基因toyF转录水平显著增强，与原始菌株相比，重组菌丰加霉素产量至少提高了31.6%。 

本发明的有益效果：