[发明专利]急性白血病病理演变前期Evi-1mRNA原位杂交检测试剂盒及检测方法和应用

说明书

技术领域

本发明涉及生物检测领域，更具体地说，是涉及急性白血病病理演变RNA表达改变(病理演变过程)的相关检测技术。 

背景技术

研究人员发现了导致急性白血病复发的一个基因，如果能找到抑制该基因发挥作用的方法，就有可能防止急性白血病的复发。急性白血病患者中有70％到80％的人都会复发。其原因是数量极少的白血病干细胞反复分裂，使白血病细胞大量增殖。抗癌药物虽然能够杀灭白血病细胞，但难以杀灭其中的白血病干细胞，造成急性白血病屡治屡发。研究证实急性白血病复发患者体内的基因“Evi-1”在造血干细胞中非常活跃，这一基因作用于白血病干细胞，使其不断分裂，导致白血病细胞大量增殖。研究人员从患白血病的实验鼠体内取出白血病细胞，去除了“Evi-1”基因后再移植到10只健康实验鼠体内。研究小组还给另外10只健康实验鼠完整移植了白血病细胞(含“Evi-1”)。结果发现，前一组实验鼠比后一组实验鼠平均晚发病一个月；而在杀灭两组实验鼠体内的白血病细胞后，前一组实验鼠没有复发急性白血病，后一组却再次发病。研究人员认为，对照实验已经说明，“Evi-1”对急性白血病的发作和复发有推动作用，而这与它作用于白血病干细胞有直接关系。本发明人在实验研究中对急性白血病患者的外周血白细胞进行检测，发现Evi-1基因过度表达，表明Evi-1基因是急性白血病干细胞的转移源头，检测Evi-1基因能预测急性白血病患者复发的可能，检测Evi-1基因就可能预测急性白血病复发几率。 

随着分子生物技术日益完善，功能基因组学，癌症基因组学等研究的深入展开，为了寻求更早期的诊断癌症、治疗癌症、以及预防癌症，已取得长足进步。至今，我们已有可能在基因的一级转录功 能产物(mRNA水平或microRNA)上做更精确的早期筛查和诊断，在急性白血医治后的早期就可以预测复发的风险。 

本发明采用核酸原位杂交技术和免疫组化方法对Evi-1急性白血病复发的早期预警进行检测分析。 

本发明人在研究中发现Evi-1作为急性白血病复发的预警有非常重要的临床诊断意义。Evi-1在急性白血病复发前期有高表达。他作于急性白血病复发前期的筛查有非常重要的临床意义。 

发明人在长期的研究中，得出了一种新理念，癌症和其它临床的重大疾病的临床诊治模式一定要改变，不能只停留现在治已病(发病后诊治)，要做到预防性诊治，做到治已病，只有这样才能降低重大疾病的发病率和死亡率，降低社会成本和医疗成本。因此，发明人在开发和生产重大疾病的RNA水平筛查试剂盒及治疗药物中，在理论和技术上都做了创新。特别是筛选临床标本(正常人群、癌症高危人群、肿瘤患者)，突破了正常组织与肿瘤组织比较的一贯性研发思路，来寻找和开发癌前变的RNA水平，与癌症早期基因病理生理学演变密切相关，而且临床意义非常重要靶标，将临床上肿瘤形成后诊治模式变成肿瘤的预防性诊治，其中包括急性白血病及急性白血病复发的早期预测，争取了肿瘤诊治的时间和空间，达到预防占位性癌症和急性白血病。 

目前，Evi-1表达谱检测方法用Northern杂交、表达芯片、实时荧光定量PCR和Solexa测序等分析技术，而这些方法多用于科研方面，不适应临床应用，而检测RNA比基因分析更科学(DNA分析大部分在易感性的表象上，RNA是功能性体现)，比蛋白分析更可靠(RNA与蛋白转录有时候不同步)。根据现有的文献资料采用原位杂交技术和组化免疫方法检测Evi-1mRNA水平表达量的检测技术及试剂盒未见报道。 

本发明人在针对创新性发明的要求，用原位杂交技术进行检测，结果表明急性白血病患者经治疗后Evi-1高表达，病患存在高度复发风险，应为患者的白血病干细胞在造血系统中大量存在，表明Evi-1可用为急性白血病复发前期筛查的重要标志物。 

原位杂交技术(in situ hybridization)是将分子生物学与 细胞化学技术结合起来，以标记的核酸分子为探针，在组织细胞原位检测特异性核酸分子的技术。其原理是使含有特异序列、经过标记的核酸单链(即探针)，在适宜条件下与组织细胞中的互补核酸单链即靶核酸发生杂交，再以放射自显影或免疫细胞化学方法对标记探针进行探测，从而在细胞原位显示特异的DNA或RNA分子。