[发明专利]葡萄酒核磁共振的代谢组学样品预处理方法

说明书

技术领域

本发明涉及基于核磁共振的代谢组学样品预处理技术，具体涉及一种以葡萄酒为样品的代谢组学样品预处理方法。 

背景技术

葡萄酒是以鲜葡萄或葡萄汁为原料，经全部或部分发酵酿制而成的，含有一定酒精度的发酵酒。医学研究表明，葡萄的营养价值很高，而以葡萄为原料的葡萄酒也富含多种氨基酸、酚类物质、矿物质和维生素等物质。目前，葡萄酒中已知的对人体有益的成分大约有600种，长期适量的饮用葡萄酒可抗衰老、预防并抑制心血管疾病和癌症的发生。 

葡萄酒是一个复杂的产物，具有很强的自然属性。它的质量受葡萄品种、酵母菌、酿酒技术以及环境的各方面包括土壤、气候和栽培技术的影响。正是如此，也使得市场上的葡萄酒种类繁多，并且各种葡萄酒之间存在着极大的差异。 

随着中国经济的持续迅猛发展以及人民生活水平的提高，中国葡萄酒在生产量和消费量上均呈现出快速增长的趋势。近年来，中国和美国逐渐成为全球葡萄酒消费大国。有报告指出，截止到2016年，中国将成为全球第二大葡萄酒消费国。预计在2012-2016年间，中国的葡萄酒销售量将增长50%。伴随着葡萄酒行业的迅速发展以及中国加入WTO之后进口瓶装葡萄酒关税由43%下降到14%，极大刺激了国外葡萄酒进口，葡萄酒市场的竞争也变得异常紊乱和激烈。 

我国现有的葡萄酒国家标准主要是针对葡萄酒的卫生指标、理化指标和感官品尝的质量控制标准。卫生指标是对于污染物、真菌毒素和微生物含量进行了限定。理化指标主要是对葡萄酒中的酒精度、总糖和还原糖、干浸出物、总酸、二氧化硫等理化成分进行了限定，并且对其相应的检测方法进行了规定。感官分析是评价员通过用口、眼、鼻等器官对葡萄酒的颜色、香气和口感及典型性感官特性进行检查与分析评定。但是由于感官分析主要依靠人的感觉，因此不可避免的存在个体的差异。如环境、温度、时间、评价员的职业水平和个人喜好等都会影响最终的葡萄酒品鉴结果。并且专业的品酒师国内也有限，因此目前实际上对葡萄酒的鉴定仅仅采用了卫生指标和理化指标。但是这些指标只考虑了影响葡萄酒质量的某些因素，仅能反映葡萄酒的健康状况，存在一定的片面性，不能用来全面的反映葡萄酒的质量，很难凭此指标检测市场上掺假、造假、以次充好的产品。因此，寻求一种便捷、快速、客观的鉴定葡萄酒质量并能对其产区、年份、品种进行区分的方法已经越来越受到人们的关注和重视。 

由于葡萄酒组成的复杂性，单独的几个指标很难准确描述其质量好坏，这就要求用整体 性的科学手段对葡萄酒的质量、产地、年份和品种进行评价。而代谢组学的研究对象为生物样品中所有内源性代谢组分，因此结合代谢组学的方法对葡萄酒进行系统研究，有助于深入认识不同葡萄酒间的代谢产物差异，为葡萄酒质量分析、品种和产区鉴别提供一定的理论依据，对葡萄酒产业的发展具有重要意义。 

基于核磁共振的代谢组学研究的流程一般包括样品的采集与制备、数据采集、数据预处理、数据分析、标志物识别等步骤。在样品制备阶段，样品的预处理和实验条件都可能对实验结果产生影响。由于代谢组学需要高通量的实验数据，为了保证实验数据的稳定性和可比较性，需要对实验条件进行规范。然而目前基于NMR的代谢组学对于样品的预处理以及实验条件没有统一的规范，目前尚无一种能够适合所有代谢产物的预处理方法，往往需要根据不同的样品选择不同的预处理，并在此基础上进行优化。本专利以葡萄酒为研究对象，研究样品的制备和实验参数对NMR实验的影响，得到适宜用于高通量试验的合理参数。 

发明内容

为了优化基于核磁共振的葡萄酒代谢组学样品预处理，本发明建立了一种样品处理的新途径。 

具体实施方法：取10mL葡萄酒，在-4℃下4000rpm离心10分钟，取上清3ml，放入20ml冻干瓶中，在-70℃冷冻过夜，然后放入冷冻干燥机冻干48小时，分别加入400μL由D2O配制的pH=4的0.2mol/L草酸盐缓冲液、140μL的D2O和60μL的0.75%DSS，混匀，13000rpm离心10分钟，取上清500μL，装入5mm核磁管中，进行NMR实验。 

NMR样品数据采集：在AVANCE600核磁共振波谱仪上采集葡萄酒样品的1H-NMR谱图。温度298K，采用1H/13C/15N探头，1H共振频率600.13MHz，1C共振频率谱宽7183.9Hz，采样点数32K，延迟时间2s，采样时间2.3s，混和时间100ms，谱线加宽因子为0.3Hz。采用预饱和脉冲序列（noesypresat）采样并抑制水峰信号，采样次数256次。 

附图说明

图1是冷冻干燥对核磁谱图的影响。