[发明专利]羊牙齿组织总RNA的提取方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种羊牙齿组织总RNA的提取方法，属于医学分子生物学技术领域。

背景技术

牙齿是机体内最坚硬的组织，其主要成分是含钙无机矿物质，约占成熟牙本质总重量的70%，有机物成分仅占20%左右。有机物主要为胶原蛋白、多糖等生物大分子物质，细胞破碎后这些物质被释放出来，可干扰总RNA的提取；同时可释放内源性RNA酶(RNase)，对RNA进行降解。羊牙齿组织中细胞含量极少且散嵌于沉积钙质中，体外进行细胞培养难度很大，欲获得纯化的牙本质细胞极为困难。羊属于反刍动物，其口腔环境藏污纳垢，微生物丛生，且含有大量外源RNase，很难采集到无菌无RNase牙齿样本。羊牙齿较大，且牙齿组织非常坚硬，不易切割，较难破碎，很难在无菌条件下进行操作；若先对牙齿组织进行脱钙处理，又会对被检核酸造成一定程度的损伤。因此，羊牙齿组织总RNA提取较为困难。

目前尚未见有羊牙齿组织总RNA提取的报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种羊牙齿组织总RNA的提取方法，使用本方法可从核酸丰度值较低、污垢细菌较多、组织块较大且坚硬如石的羊牙齿组织中，提取并获得高质量的总RNA。

本发明的技术方案由如下步骤组成：

A、用具及耗材的灭菌处理：相对于内脏组织来说，羊牙齿组织卫生状况较差，为保证牙齿总RNA提取的顺利进行，更要尽量减少外源RNase污染，因此，所有实验用具及耗材都先用0.1%的DEPC水浸泡24 h；实验耗材再经高压灭菌处理；

B、样本采集与清洗：迅速拔取牙齿后，用灭菌手术刀刮净附着的牙龈等软组织及草垢，再以4℃灭菌生理盐水反复冲洗；

C、低温破碎：冲洗后的牙齿用灭菌滤纸吸干水分，迅速放入液氮中进行低温冷冻处理，使得牙齿组织脆化而易于破碎，冷冻24～48 h后取出牙齿，用灭菌锡箔纸或纱布包裹牙齿，用灭菌处理过的铁锤，在液氮存在的情况下，迅速砸碎牙齿；

D、液氮研磨：收集铁锤砸碎的牙齿碎块到预先盛有液氮的研钵中，进行研磨；研磨过程中要及时补充液氮；研磨10～15 min，一般臼齿研磨10～12 min，切齿研磨15 min；

E、裂解细胞：收集研磨好的牙齿组织粉末80～250 mg（根据RNA丰度值不同，一般臼齿100 mg左右，切齿200 mg左右），加入到预先加有1～1.2 ml裂解液的预冷5 ml离心管中，于冰上静置20 s；

F、间歇式匀浆：匀浆过程钻头会产热，因此选择在冰浴下采用内切式匀浆机进行，转速3000 r/min，间歇性匀浆2～3 min；

G、分离DNA和蛋白质：将匀浆完成的裂解液混合物，转入2.0 ml的离心管中，25℃温浴静置5 min，以使核蛋白体完全分解；加入0.2～0.25 ml氯仿，盖紧盖子于旋涡振荡器上小幅度旋涡振荡15s，25℃温浴静置3 min；在温度为4℃条件下，以12000 g的离心力高速冷冻离心15 min，使混合物分离成三层；

H、沉淀RNA：收集上层无色的水样层至一新的离心管中，加入0.5 ml异丙醇，用手摇动使其混匀，25℃温浴静置10 min；在4℃下以12000 g的离心力高速冷冻离心10 min，可见离心管底部附着一胶状小片沉淀即为RNA；

I、洗涤RNA：移去上层悬液，加入1 ml 75%乙醇溶液，旋涡振荡洗脱，至片状沉淀飘起，在4℃下以7500 g的离心力高速冷冻离心5 min；

J、RNA再溶解：弃去上清液，在超净工作台中自然干燥RNA沉淀5～10 min，加入10 μl的0.1%DEPC处理水，于55～60℃下进行金属浴加热10 min；提取的总RNA分装后保存于－80℃。

本发明的优点在于：本方法是从动物机体最坚硬的牙齿组织中提取总RNA的方法。本方法具有简单、快速、无需对牙齿进行脱钙、易操作等优点；提取的牙齿总RNA浓度高，纯度好，无需进行RNA纯化；减少了提取步骤，缩短了提取时间；且可以批量提取，实验室条件允许的话，一上午可以提取高质量的牙齿组织总RNA样本64个以上，且可用于实时荧光定量PCR。

提取的RNA可应用于牙齿组织中特定基因的表达分析、荧光定量PCR检测、牙科遗传性疾病的诊断等。

附图说明

图1是本发明工艺流程图。

具体实施方式

下面结合附图对本发明作进一步说明。