[发明专利]用于检测椰子败生类病毒的引物、试剂盒及检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种用于RT-PCR检测椰子败生类病毒的引物、试剂盒及检测方法，属于生物技术领域。

背景技术

椰子败生类病毒Coconut tinangaja viroid(CtiVd)属于马铃薯纺锤形块茎类病毒科（Pospiviroidae）,椰子死亡类病毒属（Cocadviroid）,是椰子致死性病害，主要发生在关岛，目前我国还没有发现该类病毒，已被列为我国进境的检疫性病原物。椰子是我国重要的经济作物，因此加强对该类病毒的检疫和鉴定技术研究，对严防该类病毒传入我国具有非常重要的意义。椰子败生类病毒主要侵染椰子树，造成椰子植株生长受阻，提前凋亡。椰子败生类病毒的传播途径：自然条件下随种苗传播。椰子败生类病毒的类病毒特性：环状RNA，由254个核苷酸组成。

现有用于RT-PCR检测椰子败生类病毒的引物其特异性相对不够强，灵敏性相对较差，这往往会造成检测结果准确性不高。

发明内容

本发明的目的是为了克服现有技术中的不足之处，提供一种用于RT-PCR检测椰子败生类病毒的引物以及包含该引物的试剂盒及检测方法，利用该引物及检测方法检测椰子败生类病毒准确性高，特异性强、灵敏性高。

为了达到上述目的，本发明采用以下方案：

一种用于检测椰子败生类病毒的引物，其特征在于：

引物序列

CTIVD Primer-1:5'-actcgagcttttattacacagggcgctgcaaag-3'，

CTIVD Primer-2:5'-gtcgccgattcgtgctggttgggcttcgtc-3'。

一种检测椰子败生类病毒的试剂盒，其特征在于该试剂盒包括有：

A、Enzyme Mix                100μl

B、Buffer                    625μl×2

C、CTIVD Primer-1                50μl

D、CTIVD Primer-2               50μl

E、Positive Control          50μl

F、RNase Free dH₂O           1000μl；

其中所述的CTIVD Primer-1序列为：

5'-actcgagcttttattacacagggcgctgcaaag-3'；

所述的CTIVD Primer-2序列为：

5'-gtcgccgattcgtgctggttgggcttcgtc-3'。

如上所述的一种检测椰子败生类病毒的试剂盒，其特征在于所述的Enzyme Mix包括反转录酶、PCR扩增用的Taq 聚合酶、RNA酶抑制剂；所述的Buffer包括MgCl₂ 25mM、dNTPs 10mM；所述的PositiveControl为椰子败生类病毒的核酸；所述的RNase Free dH₂O为除去RNA酶后的去离子水。

一种椰子败生类病毒的检测方法，其特征在于包括以下步骤：

A、待测样品RNA提取，得模板RNA溶液；

B、将步骤A中的模板RNA溶液反转录成cDNA，再采用引物CTIVD Primer-1和CTIVD Primer-2对进行PCR扩增，得PCR反应液；

其中所述的CTIVD Primer-1序列为

5'-actcgagcttttattacacagggcgctgcaaag-3'；所述的CTIVD Primer-2序列为5'-gtcgccgattcgtgctggttgggcttcgtc-3'；

C、取PCR反应液进行琼脂糖凝胶电泳分析；

D、若存在138bp的DNA条带，则证明所检测用品中待有椰子败生类病毒。

本发明中所述138bp的序列为：

Gtcgccgattcgtgctggttgggcttcgtcccttccgagcttcgatccgacgccc ggccgcttcctcgccgaagctgctacggagactacccggtggatacaactctttgcagc gccctgtgtaataaaagctcgagt。

如上于步骤A中所述待测样品组织总RNA提取，具体包括如下步骤：