[发明专利]一种半滑舌鳎性别相关基因及其重组蛋白制备方法与应用

说明书

技术领域

本发明属于水产生物技术中的功能基因筛选与应用技术领域，具体涉及半滑舌鳎性别相关基因CSsr1的克隆、体外重组表达及其表达产物的活性分析。

背景技术

半滑舌鳎（Cynoglossμs semilaevis）是一种近海温水性大型底栖鱼类，其肉质鲜美、营养丰富，深受消费者喜爱，是我国海水养殖主导鱼类之一。但半滑舌鳎雌、雄个体生长速度差异很大，雌性比雄性生长快2-4倍。由于雄性个体生长缓慢、个体小等原因，致使增加了半滑舌鳎的养殖成本、降低了养殖产量，严重影响了半滑舌鳎苗种的推广及养殖产业的发展。因而开展半滑舌鳎性别决定关键基因的筛选鉴定及其功能的分析研究是揭示半滑舌鳎性别决定机制、探索雌雄生长差异的分子机理、建立性别控制技术的重要任务。

在鱼类性别决定的分子机制的研究中，人们对哺乳动物的许多性别决定的同源基因进行了研究，这为从分子水平上阐明动物的性别决定和分化机制奠定了基础。但是，很多在其他脊椎动物中与性别决定相关的基因在鱼类中并没有性别的差异，说明鱼类有其特有的性别决定机制。因此，目前人们又逐渐转向寻找鱼类自身性别决定基因的研究上来。例如，在青鳉（Oryzias latipes）Y染色体上的性别决定相关区段发现了一个性别决定基因DMY，该基因是迄今为止在鱼类Y染色体上找到的与精巢发生和分化直接相关证据最充分的1个性别决定功能基因。但后来在一些与青鳉亲缘关系非常相近的物种及其他硬骨鱼类的研究中并未能找到DMY的同源基因（Matsuda et al.，2003；Volff et al.,2003;Kondo et al.,2003），而在其它鱼类尚未见有关性别决定基因克隆的成功报道。有关鱼类性别决定相关基因，特别是半滑舌鳎性别决定基因的筛选与克隆以及性别决定分子机制的研究是目前国内外急待攻克的重要科学问题，也是建立半滑舌鳎性别控制和全雌苗种培育技术的重要基础。

发明内容

本发明的目的是筛选半滑舌鳎性别决定相关基因，获得性别相关基因的序列，进行体外重组表达，获得重组表达产物，鉴定重组表达产物的生物活性及基因的功能，为半滑舌鳎性别控制和全雌苗种研制提供基因资源和技术方法。

本发明一个方面涉及半滑舌鳎性别相关基因CSsr1，其氨基酸序列为SEQ IDNO:1；

编码上述的性别相关蛋白CSsr1的基因，其核苷酸序列为SEQ ID NO:2。

本发明的另一个方面涉及用于重组表达CSsr1蛋白的重组质粒，

本发明的半滑舌鳎性别相关蛋白在半滑舌鳎性别控制中的应用。

本发明的CSsr1基因与半滑舌鳎性逆转密切相关，其体外重组蛋白能够明显升高卵泡抑素FST基因的表达水平，并在短期内抑制雌性相关基因P450,Foxl2和CTNNB1的表达，抑制CSsr1基因的表达可能降低半滑舌鳎性逆转比例，因此，在半滑舌鳎性别控制和提高雌性鱼苗比例方面具有应用潜力。

附图说明

图1：本发明构建的原核表达载体图谱；

图2：半滑舌鳎CSsr1重组表达蛋白SDS-PAGE分析；

其中A:PET-32-CSsr1诱导不同时期采样SDS电泳图，M：标准分子量marker，1-3:诱导6h，4-5:诱导4h，6-7:诱导2h，8-9:pet-32a诱导6h.B:重组蛋白纯化SDS电泳图，1：纯化重组蛋白，2:标准分子量marker。

具体实施方式

下面结合附图实例对本发明的方法做进一步说明。但实例仅限于说明，并不限于此。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常可按常规条件，如J.萨姆布鲁克（Sambrook）等编写的《分子克隆实验指南》中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件运行。

一、半滑舌鳎性别相关基因CSsr1的克隆及其序列

通过半滑舌鳎全基因组测序，转录组和生物信息学分析获得半滑舌鳎性别相关基因CSsr1的部分cDNA序列，然后设计引物从半滑舌鳎精巢中克隆到了性别相关基因CSsr1的全长cDNA，其全长序列为SEQ ID NO:2，编码的氨基酸序列为SEQ ID NO:1。

半滑舌鳎性别相关基因CSsr1的cDNA编码序列为519bp，见SEQ ID NO:2序列。

具体步骤如下：

1、半滑舌鳎性别相关基因CSsr1 cDNA片段的克隆