[发明专利]鸡艾美耳球虫弱毒疫苗产业化生产工艺

说明书

技术领域

本发明涉及从鸡感染性粪便中分离、纯化艾美耳球虫卵囊并制备活卵囊疫苗的技术，特别指鸡艾美耳球虫弱毒疫苗产业化生产工艺。

背景技术

鸡艾美耳球虫早熟弱毒疫苗的制备依赖于从感染性粪便中分离卵囊，而球虫卵囊的分离与纯化是一项十分复杂的工作。现有的生产工艺移植于实验室的分离技术，应用饱和盐水漂浮法分离卵囊。其主要原理是：由于球虫卵囊的密度(1.103～1.064)介于水和饱和盐水的密度之间，当将含有杂质的卵囊溶液放在水中离心机离心时，卵囊和少量的物质比水密度大一起下沉，由于浮力作用，比水密度小的杂质上浮，离心后，弃上清液，除去了比水密度小的杂质；当将含有杂质的卵囊溶液放在饱和盐水(蔗糖溶液、饱和硫酸镁和饱和铬硫酸)中离心时，由于浮力作用，卵囊和少量的物质比饱和盐水密度小一起上浮，离心后，弃沉淀，除去了比饱和盐水密度大的杂质。随后，分离的卵囊用次氯酸钠处理，去除细菌和卵囊表面的粘附物，配制疫苗。

饱和盐水漂浮法是实验室最常用的球虫卵囊分离技术，该技术相对简单，易于掌握，可重复性好，结果可靠。但用于产业化生产有严重缺陷，主要表现为：①筛分效率低，不能实现管道化连接和机械化生产；②离心物料量过大，离心机数量要求多，离心时间长。这些原因是造成疫苗产能量小、产业化程度低的直接因素，并进一步导致疫苗的成本上升，影响了疫苗的推广与使用。

艾美耳属(Eimeria)球虫(Coccidium)是寄生于鸡肠道的一类专性寄生原虫，引起鸡球虫病(Coccidiosis)。据统计，全世界已报道的鸡球虫共有15种，其中，有5种具有明显的致病性，它们是：柔嫩艾美耳球虫(E.tenella)、毒害艾美耳球虫(E.necatrix)、巨型艾美耳球虫(E.maxima)、堆形艾美耳球虫(E.acervulina)及和缓艾美耳球虫(E.mitis)。这5种球虫中，有3种对雏鸡具危害性，它们是：柔嫩艾美耳球虫、巨型艾美耳球虫和堆形艾美耳球虫。

球虫病是一种普遍存在的感染性疫病，世界上凡是有鸡的地方就会有鸡球虫及鸡球虫病的发生，而规模化鸡场是鸡球虫病易发生的适宜场所，常常出现该病的爆发。鸡球虫病是一种感染迅速，传播快而广泛，且致病率、致死率极高的烈性感染病，在防治不当的情况下，感染率和死亡率均高达50％以上。因此，鸡球虫病对养禽业造成严重的经济损失，全球每年因该病造成的经济损失高达数百亿元人民币，我国每年因该病造成的损失也不少于百亿元。在养鸡业集约化不断提高的今天，防治鸡球虫病是养鸡业疫病防控工作中不可缺少的环节。

从上世纪80年代，鸡球虫病的防控取得了重大进展，主要得益于大量抗球虫药物的出现，并取得令人满意的成效。然而，大量的抗球虫药物多为化学类产品(如氯苯胍、尼卡巴嗪、二硝托胺、地克珠利、尼卡巴嗪和磺胺类药物)和抗生素类产品(如莫能菌素、盐霉素、拉沙菌素、那拉菌素、马杜霉素、海南霉素)。这些产品的长期使用必然导致抗药性和药物残留现象的出现。而各种抗球虫药物的使用均为伴料给药。实际上在上世纪90年代抗药现象已十分普遍，在这种情况下新药的研制压力聚增，养鸡企业的防控难度日益加大。

进入21世纪以来，全球范围内化学药品和抗生素的使用受到限制，食品安全制度受到越来越多的关注，发达国家已基本禁止了化学抗球虫药物的使用，抗生素类抗球虫药物的使用也受到明显的限制。在美国、日本和欧共体已明令禁止此类产品出现在饲料中。在我国由于各种抗球虫药物不加限制的应用，抗药性已普遍产生，有的产品(如莫能菌素)已无临床使用价值。近年来我国的食品安全政策开始实施，同时消费者自身的健康意识日益增强，抗球虫药物的市场日渐萎缩，而且，我国也将在近期实施禁止或限制使用抗球虫药物的市场政策，这样鸡球虫病的防治形势骤然紧张。

为了有效防治鸡球虫病，确保养鸡业的健康发展，迫切需要寻找新的防治方法，这其中疫苗接种预防是具有前途的途径之一。然而，传统的疫苗制造技术不适用于产业化生产，急切需要适于规模化生产技术工艺。发明专利“鸡艾美耳球虫卵囊批量制备方法”(专利号：2011100291271.6)公开了球虫卵囊的批量分离纯化技术，是鸡球虫疫苗生产的关键技术之一，但不能解决疫苗制备的全部工艺，特别是疫苗固体制剂。

鸡球虫疫苗的生产有赖于从感染鸡粪中分离卵囊，再将卵囊合理配比制备疫苗。现有的疫苗生产工艺简述如下：含卵囊鸡粪→稀释混合→60目筛分过滤→200目筛分过滤→离心粗分→饱和盐水细分→离心脱盐→卵囊消毒→孢子化→卵囊计数→卵囊配比→分装