[发明专利]叶酸-腺病毒肿瘤靶向性复合物及其制备法

说明书

技术领域

本发明涉及一种叶酸与腺病毒的复合物：叶酸-腺病毒（FA-Ad5-TRAIL）。

背景技术

腺病毒是一种无被膜的二十面体的病毒，约有50余种血清型，目前的研究比较集中在血清型2和血清型5上。其衣壳蛋白由240个六邻体、12个五邻体组成，介导腺病毒与受体细胞的接触和进入。其基因组为一个长约36Kb的双链DNA分子，由早期转录单位(E1A，E1B，E2，E3，E4)、主要晚期转录单位(L1-L5)、包装信号及两端的末端反向重复(inverted terminal repeat，ITR)序列组成，调节病毒的转录和病毒蛋白的形成。腺病毒进入宿主细胞进行复制分为4个阶段：感染，早期事件，晚期事件和包装。腺病毒感染细胞的第一步是通过纤维蛋白与细胞表面的柯萨奇病毒和腺病毒受体(cosakie and adenovirus receptor，CAR)结合。腺病毒粘附后，五邻体蛋白上的精氨酸-谷氨酸-天门冬氨酸(arginine-glycine.aspaarticacid，简称RGD)与细胞表面的整合素(intergrin)αVβ3和αVβ5结合并相互作用使病毒进入细胞。腺病毒一旦进入胞浆，经外壳蛋白上的核定位信号入核，进行转录单位的表达。

trail基因（肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体）作为TNF超家族成员由Wiley等在1995年根据TNF家族成员的同源性序列克隆并命名。已知trail的受体有五种：trail-RI/DR4、trail-R2/DR5、trail-R3/DcR1和trail-R4/DcR2以及OPG。其中trail-Rl/R4和trail-R2/R5包含细胞质的死亡区域及凋亡信号，而另两个诱骗受体trail-R3/DcR1和trail-R4/DcR2则缺少功能性死亡区域且不能介导凋亡。诱骗受体DcR1和DcR2在正常组织中有广泛的表达，而在肿瘤细胞系或新鲜分离的肿瘤组织中却未见表达，同时很多肿瘤细胞优先表达DR4和DR5。因此，正常细胞由于有诱骗受体与DcR4和DcR5竞争性结合trail而逃逸trail的杀伤，肿瘤组织则由于缺乏诱骗受体的保护而易被trail杀伤。trail能够特异性地诱导转化细胞、肿瘤细胞和病毒感染细胞，而对正常组织细胞没有杀伤作用，这是它不同于其它凋亡诱导分子的一个显著特征。正是这一特征，使其具有潜在的靶向抗癌前景。

目前，腺病毒载体的应用在肿瘤的临床基因治疗中占有很大地比例，作为一种高效侵染的基因载体，并不会把自身的基因组插入宿主染色体中，宿主细胞范围广泛而且经过基因敲除的腺病毒缺少相应的应答能力，大大降低其免疫毒性。作为载体常用的2型和5型腺病毒，其天然形式对细胞的感染是由纤维蛋白与细胞表面的CAR结合而介导的，腺病毒对组织的感染主要取决于CAR的表达水平。在人体中，CAR广泛表达于各种上皮组织，而在许多肿瘤组织中存在CAR不同程度的下调或缺失。因此，系统应用的腺病毒往往被截留在正常上皮细胞，尤其是肝细胞中，而感染肿瘤细胞的病毒量则明显减少，这样大大降低了Ad载体的转染效率。此外，为维持目的基因长时间表达，往往采用重复注射手段，引起宿主强烈地免疫性反应，诱发机体毒性。这些不利因素大大限制了Ad载体在临床上的运用和发展。另外，腺病毒的感染谱很广，它可感染包括肺细胞，肝细胞、骨细胞、血管、肌肉、脑、中枢神经系统等在内的各类分裂细胞和非分裂细胞。要想实现有效的抗肿瘤基因治疗，就必须构建肿瘤靶向性腺病毒载体，通过病毒对肿瘤细胞的靶向感染来实现对目的基因的靶向转移，这样不仅可以增加向靶组织的基因转移，同时也避免了病毒在非靶组织的截留，从而提高疗效，避免对全身系统和非靶向器官的毒性作用，降低免疫反应。