[发明专利]一种牛乳β-乳球蛋白定量检测试剂盒及其应用

说明书

（一）技术领域

本发明涉及一种可测定乳或乳制品中热变性和非变性的常量或微量的牛乳β-乳球蛋白定量检测试剂盒及其应用。

（二）背景技术

牛乳是FAO/WHO认定的导致人类食物过敏的八大类食品之一，是导致儿童食物过敏的常见食物，它在儿童中的发病率为0.1～7.5%，严重危害婴幼儿健康。而其中的牛乳β-乳球蛋白被认为是主要的过敏原。

牛乳β-乳球蛋白（Bovineβ-lactglobulin，β-LG）是牛奶当中蛋白质的一种，约占鲜奶蛋白质的7-12%。在细胞及动物实验研究中发现，β-乳球蛋白的水解物或分子修饰物，具有降胆固醇与抗氧化等生理活性。前人研究发现牛乳β-乳球蛋白存在多种形式的遗传变异体，其中最主要的为变异体A（β-LG A）和B（β-LG B），它们之间的区别在于氨基酸序列中第64和118处两个氨基酸残基的不同（A中的ASP₆₄和Val₁₁₈分别改变为B中的Gly₆₄和Ala₁₁₈），而人乳则完全不含β-乳球蛋白。

牛乳β-乳球蛋白是由162个氨基酸残基组成的结构紧密的单体球蛋白，每个单体含有两个二硫键Cys₆₆-Cys₁₆₀和Cys₁₀₆-Cys₁₉₉，还有一个Cys₁₂₁自由巯基。结构相对稳定，遗传变异体β-LG A的平均分子量为18363Da，遗传变异体β-LG B的平均分子量为18277Da,牛乳β-乳球蛋白平均分子量为18320Da。由于原料质量混杂、加工工艺不同等原因造成产品质量良莠不齐，但又没有用于监测乳与乳制品中β-乳球蛋白（包括β-LG A和β-LG B）的准确有效的定量检测方法，其中主要原因是缺少用于准确定量测定的方法和必要的实验材料。

目前国内外用于牛乳β-乳球蛋白的检测方法仍以SDS-PAGE法为主，该法为半定量方法，不能进行准确定量，由于操作繁琐无法在普通的实验室进行推广；有人提出了应用GPC-UV的检测方法，由于凝胶色谱柱的分辨力低，紫外光检测灵敏度低的原因，而不能用于复杂基质或低含量的样品检测；Christoph Czerwenka（2007）等人采用LC-MS联用方法测定牛奶和乳制品中牛乳β-牛乳球蛋白的含量，在正离子电喷雾模式下，选用全扫描提取离子的方式，使用山羊奶和水牛奶的两种β-乳球蛋白变异体作为内标物，前者在样品处理前加入，避免样品在处理过程中的损失，克服了回收率低、基质干扰大等问题，后者在样品处理后加入，更加准确定量。但未对此进行系统的方法学的验证。任一平（2010）等建立了LC-ESI-MS测定婴幼儿配方中的牛乳β-乳球蛋白的方法，样品经直接提取，根据蛋白在电喷雾离子化条件下会产生多电荷离子的原理，采用选择离子扫描模式（SIR）进行检测，该方法只限于试样中非变性的牛乳β-乳球蛋白的定量检测，无法测定因热处理而变性的牛乳β-乳球蛋白。经查询，至今为止还未发现应用同位素标记内标肽稀释法，结合RPLC-ESI-MS/MS同时测定乳与乳制品中热变性和非变性牛乳β-乳球蛋白的定量方法。

（三）发明内容

本发明目的是提供一种应用同位素标记内标肽稀释法，结合RPLC-ESI-MS/MS测定乳与乳制品中热变性和非变性牛乳β-乳球蛋白的试剂盒及其应用。

本发明采用的技术方案是：

一种牛乳β-乳球蛋白定量检测试剂盒，主要包括牛乳β-乳球蛋白特异肽、同位素标记牛乳β-乳球蛋白特异肽和同位素标记牛乳β-乳球蛋白内标物，所述牛乳β-乳球蛋白特异肽的氨基酸序列为：TPEVDDEALEK；所述同位素标记牛乳β-乳球蛋白特异肽的氨基酸序列为：TPEV^*DDEAL^*EK，其中V^*和L^*为碳氮全同位素标记的氨基酸；所述同位素标记牛乳β-乳球蛋白内标物（图1）的氨基酸序列为：CQCLVRTPEV^*DDEAAL^*EKFDKALKA，其中V^＊和L^＊为碳氮全同位素标记的氨基酸。