[发明专利]姬松茸SSR分子标记、其制备方法及在鉴别姬松茸菌株上的应用方法

权利要求书

1.姬松茸SSR分子标记，其特征在于：该分子标记引物的序列如下①引物A 5’-CTCTCTCTTCCATCATCCTCT-3’和5’-CGCCAGTTGTGCACAT-3’； ②引物B 5’-CGCATCTTGGGCTCCTT-3’和5’-GGGGAAGCACGATCGTT-3’； ③引物C 5’-CTCCCTATGACCAACAGCA-3’和5’-CCCCACGGATTGCC-3’；④引物D 5’-CCGCACTCTCCTCCAGTT-3’和5’-GTGAGTCTGT GTGTGTGTGAGT-3’。

2.根据权利要求1所述的姬松茸SSR分子标记的制备方法，其特征在于：其包括以下步骤，

   ⑴、CTAB 法提取姬松茸基因组DNA：①、称取0.1g姬松茸Co⁶⁰辐射诱变菌株J2～J66的菌丝或子实体，用去离子水冲洗干净后，迅速转入1.5ml离心管中；②、加入液氮，迅速用电钻捣碎，后加入600mlCTAB 并于65℃水浴1h，并每20min反转摇匀一次；③、加入等体积调制的氯仿-异戊醇，使步骤（1）②获得的溶液与氯仿-异戊醇体积比24:1，颠倒混匀后，于12000rpm离心6min，取上清液于新管中；④、向上清液中加入其2倍体积的无水乙醇或其2/3体积的异丙醇，于-20℃放置20min；⑤、步骤（1）④的溶液于12000rpm离心6min，去上清液后，加入75％乙醇清洗DNA于12000rpm离心2min后，再次去上清液；⑥、将步骤（1）⑤制得的DNA风干后加入50μl的TE缓冲液；

   ⑵、利用链霉素磁珠富集与生物素标记的探针杂交的技术分离姬松茸基因组DNA的SSR微卫星序列并对其测序；

   ⑶、针对姬松茸基因组DNA的SSR微卫星序列进行引物设计，并用引物姬松茸基因组DNA进行PCR扩增，通过聚丙烯酰胺凝胶电泳获得的电泳图检测菌株扩增出的特异条带，从而筛选出能够通过扩增出的特异条带进行姬松茸菌株鉴别的SSR分子标记引物：①引物A 5’-CTCTCTCTTCCATCATCCTCT-3’和5’-CGCCAGTTGTGCACAT-3’； ②引物B 5’-CGCATCTTGGGCTCCTT-3’和5’-GGGGAAGCACGATCGTT-3’； ③引物C 5’-CTCCCTATGACCAACAGCA-3’和5’-CCCCACGGATTGCC-3’；④引物D 5’-CCGCACTCTCCTCCAGTT-3’和5’-GTGAGTCTGT GTGTGTGTGAGT-3’。

3.根据权利要求1所述的姬松茸SSR分子标记在鉴别姬松茸菌株上的应用方法，其特征在于：其包括以下步骤，

  ⑴、用所述姬松茸特异SSR分子标记引物①引物A 5’-CTCTCTCTTCCATCATCCTCT-3’和5’-CGCCAGTTGTGCACAT-3’； ②引物B 5’-CGCATCTTGGGCTCCTT-3’和5’-GGGGAAGCACGATCGTT-3’； ③引物C 5’-CTCCCTATGACCAACAGCA-3’和5’-CCCCACGGATTGCC-3’；④引物D 5’-CCGCACTCTCCTCCAGTT-3’和5’-GTGAGTCTGT GTGTGTGTGAGT-3’分别对姬松茸基因组DNA进行PCR反应：PCR反应体系为：25μl的PCR反应体系中包括提取的DNA溶液1μl,10nmol/L引物2μl,其中上下游引物各1μl ，12.5mmol/L dNTP 2μl,10×PCR buffer 2.5μl, Taq DNA聚合酶1U；PCR反应程序为：94℃预变性7min；随后30个循环，每个循环94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s；最后72℃延伸10min；

  ⑵、对步骤⑴所得PCR产物进行聚丙烯酰胺凝胶电泳、银染显色，得到电泳图片；

  ⑶、对PCR产物电泳图片进行条带分析，通过以下菌株的特异条带对菌株品种进行鉴别：①引物A：仅缺243bp条带鉴别出菌株J22、J26、J29、J30；同时缺224、243bp条带鉴别出菌株J3、J19、J38、J54；197bp条带鉴别出菌株J29、J31；②引物B：318bp条带鉴别出菌株J19；372bp条带鉴别出菌株J45；389bp条带鉴别出菌株J65；426bp条带鉴别出菌株J51；③引物C：244bp条带鉴别出菌株J14；④引物D：106bp条带鉴别出菌株J19；201bp条带鉴别出菌株J45。