[发明专利]一种基因打靶系统

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种基因打靶系统。

技术背景

基因组的靶向修饰包括对基因组内源性基因序列的改造或者在基因组的特定位置插入外源性基因片段。这项技术为研究特定基因功能提供了有力工具，此外研究人员可以利用该技术建立特定的动物模型来进行基因功能研究或新药物的研发。传统的基因靶向修饰技术是依赖于自然状态下的同源重组（Homologous recombination，HR），效率非常低，大约为10^-6，因而大大限制了该技术的应用。近几年来锌指核酸酶（Zinc finger nucleases,ZFN）、转录激活子样效应因子核酸酶（Transcription activator-like effector nucleases，TALEN）、RNA介导的Cas9核酸酶（RNA:Cas9）等位点特异性切割核酸酶技术的出现给基因组靶向修饰带来了希望。

ZFN、TALEN、RNA:Cas9等位点特异性切割核酸酶技术是近年来发展起来的一项新的技术，通过人工设计的ZFN、TALEN或sgRNA:Cas9在基因组DNA的特定位置切割产生双链断裂（DSB），继而通过细胞内源性的修复机制对断裂部位的基因进行修饰。同自然状态下的同源重组技术相比较，该技术可以使基因组靶向修饰的效率提高了10³～10⁵倍。位点特异性切割核酸酶介导的基因定点修饰已经在多种体外培养的细胞中获得成功，包括人的胚胎干细胞(embryonic stem cell,ES)和诱导性多能干细胞(induced pluripotent stem cells,iPS)、植物、果蝇、爪蟾、线虫、斑马鱼、小鼠、大鼠等的细胞，显示出该技术的广泛适用性，这将有力地推动基因靶向修饰技术的应用研究。

位点特异性切割核酸酶介导的基因靶向修饰需要将位点特异性切割核酸酶和供体DNA同时导入到靶细胞中，其中对供体DNA的需求量要高于位点特异性切割核酸酶，多数情况下将位点特异性切割核酸酶和供体DNA导入靶细胞的比例为1:5～1:10，如何有效提高将供体DNA导入到靶细胞中的效率成为影响基因靶向修饰效率的重要因素，尤其是对于那些转染效率低的细胞或者在体内基因靶向修饰中。

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于克服上述供体DNA导入靶细胞效率的不足，提供一种能产生多个供体DNA片段、效率高的基因打靶系统。

解决上述技术问题所采用的技术方案是：由位点特异性切割核酸酶表达载体和打靶载体两部分组成。本发明的打靶载体包含2～10个供体DNA片段，每个供体DNA片段的5＇端和3＇端分别插入位点特异性切割核酸酶的识别序列，供体DNA由上游同源臂、下游同源臂和位于两者之间的外源DNA序列组成。上述的位点特异性切割核酸酶表达载体是携带锌指核酸酶的表达载体、转录激活子样效应因子核酸酶的表达载体、RNA介导的核酸酶RNA:Cas9的表达载体中的任意一种。

本发明的位点特异性切割核酸酶的识别序列是基因组上位点特异性切割核酸酶结合的长度为20bp～50bp的DNA序列。

本发明的外源DNA序列是长度为1bp～3000bp的DNA片段。

本发明的上游同源臂、下游同源臂是分别与位点特异性切割核酸酶识别位点上游和下游的部分基因组序列同源的两段长度为50bp～3000bp的DNA片段。

本发明的部分基因组序列是距离锌指核酸酶识别位点1bp～3000bp的DNA序列。

本发明采用由位点特异性切割核酸酶表达载体和携带多个供体DNA片段的打靶载体组成的基因打靶系统，在供体DNA片段之间引入了位点特异性切割核酸酶的识别序列，通过位点特异性切割核酸酶在细胞内对打靶载体的切割产生多个供体DNA片段，有效地提高供体DNA进入靶细胞的水平，从而提高基因打靶的效率。

附图说明

图1.是AAVS1ZFN表达载体结构图。

图2是AAVS11000F供体DNA结构图。

图3.是携带多个供体DNA片段的打靶载体结构图。

图4是pE1/EGFP/4×AAVS1-TSF-Donor靶向修饰效率检测。

图5是CCR5ZFN表达载体结构图。

图6是携带SNCA ZFN表达元件的腺病毒结构图。

图7是携带靶向SNCA位点的供体DNA的腺病毒结构图。