[发明专利]鉴别猪瘟病毒强毒株和疫苗弱毒株的RT-PCR检测试剂盒

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种试剂盒，具体地说，涉及一种鉴别猪瘟病毒强毒株和疫苗弱毒株的RT-PCR检测试剂盒。

背景技术

猪瘟(Classical swine fever，CSF)是由猪瘟病毒(Classical swine fever virus，CSFV)引起猪的一种高度接触性和致死性传染病。世界各国对猪瘟都采取严格的防控措施，欧盟国家普遍采取对猪瘟病毒感染猪和猪瘟患病猪进行扑杀的政策，只有在有证据表明出现猪瘟扩散的情况下才采取疫苗的紧急免疫接种。在大多数存在养猪业的发展中国家，采取疫苗免疫接种是防控猪瘟的一项基本措施，猪瘟兔化弱毒疫苗(HCLV株，又称C-株)是中国在20世纪50年代发明的一个优秀的猪瘟弱毒活疫苗，其具有免疫保护确实，对怀孕母猪安全性好的优点，为猪瘟的防控起到了重要作用。但是，目前猪瘟在世界范围内仍有发生，特别是近二十年来猪瘟的流行特点发生了明显的变化，临床上以母猪流产、仔猪长期带毒等“非典型性猪瘟”和“慢性猪瘟”为主，主要原因是由于仔猪母源抗体的干扰和免疫耐受而造成免疫失败，使得猪瘟病毒野毒进入免疫猪群和无猪瘟猪群，引起猪群发病，造成严重的经济损失。猪群中抗猪瘟病毒免疫抗体的高低是评价猪瘟疫苗免疫效果和猪群是否获得免疫保护的重要指标，但常规的血清学方法只能检测出抗猪瘟病毒抗体水平的高低，并不能区分高水平抗猪瘟病毒抗体的产生是由于猪瘟病毒强毒感染还是疫苗免疫接种激发的。通过敏感、特异、有效的方法来鉴别猪瘟病毒强毒感染猪和疫苗免疫猪，将猪瘟病毒强毒感染猪从猪群中剔除，建立无猪瘟病毒感染猪群是当前猪瘟防控的重要措施。

在中国，猪瘟病毒石门株是流行毒株的代表，目前在猪群中也存在一些来自欧洲的猪瘟病毒株，使得国内猪群中猪瘟病毒流行毒株呈现较为复杂的状况，对猪瘟的防控带来了较大困难。研究可鉴别猪瘟病毒强毒株和疫苗弱毒株(C-株)的抗原检测方法，发现猪瘟弱毒疫苗免疫猪群中的猪瘟病毒强毒感染猪，进而对其进行净化处理，是猪瘟防控的重要工作。国内外建立了多种猪瘟病毒强毒株(野毒株)和疫苗弱毒株的鉴别检测方法，如套式RT-PCR、实时荧光定量RT-PCR、多重RT-PCR等，但还未见到研制成猪瘟病毒强毒株和疫苗弱毒株鉴别检测试剂盒的报道。本课题组在对猪瘟病毒石门株、流行毒株和疫苗弱毒株(C-株)全基因序列比对分析的基础上，筛选强毒株和弱毒株的差异基因序列设计引物，建立了鉴别猪瘟病毒强毒株和疫苗弱毒株的RT-PCR检测方法。

为了更便于一般检测实验室、生猪养殖单位和动物疫病防控机构等利用建立的方法对猪群中猪瘟病毒强毒感染猪和弱毒疫苗免疫猪进行鉴别检测。本研究对RT-PCR的反应体系、反应条件和组分进行了优化，组装成一种使用方便、快速，适用于猪瘟病毒强毒株和疫苗弱毒株鉴别的RT-PCR检测试剂盒。

发明内容

为了解决上述技术问题，本发明提供一种鉴别猪瘟病毒强毒株和疫苗弱毒株的RT-PCR试剂盒。在建立高灵敏度和特异性RT-PCR方法的基础上，通过对试剂成分的整合，组装成可以快速检测鉴别猪瘟病毒强毒感染猪和疫苗免疫猪的试剂盒，可用于临床样品和病毒感染的细胞培养物的检测。

其技术方案如下：

一种鉴别猪瘟病毒强毒株和疫苗弱毒株的RT-PCR检测试剂盒，其组成成分包括：A.反转录组合RT、B.PCR组合、C.稀释液、D.阳性对照：

A.反转录组合由A1和A2成分组成，A1分别含5×PrimeScript Buffer、Oligo dT、Primer Random 6 mers，其体积比为4∶1∶4，共250μL；A2为PrimeScript RT Enzyme Mix I反转录酶5U/μL，共30μL；

B.PCR组合由B1、B2、B3三种成分组成，B1为2×PCR预混液，共1000μL；B2为猪瘟病毒强毒上游引物SF、弱毒上游引物CF混合物(10μmol/L)，共60μL；B3为猪瘟病毒强毒下游引物SR、弱毒下游引物CR混合物(10μmol/L)，共60μL；

C.稀释液为焦碳酸二乙酯(DEPC)处理的灭菌水，共1000μL；

D.阳性对照为灭活的猪瘟病毒石门株和C-株细胞培养物，共1000μL。

进一步优选，B2中引物混合物按照等摩尔比组成。

进一步优选，B3中引物混合物按照等摩尔比组成。