[发明专利]胚胎干细胞特异性标志物Aire及其应用

说明书

技术领域

本发明属于细胞生物学及免疫学领域，具体地说，涉及胚胎干细胞特异性标志物Aire及其应用。

背景技术

胚胎干细胞（embryonic stem cells,ES cells）是指从胚胎内细胞团分离获得的，能在体外长期培养并保持自我更新能力和分化为所有三个胚层细胞潜能的正常二倍体细胞。胚胎干细胞的高度自我更新能力和分化全能性是它区别于其它细胞的重要特征，它的特异性分子标志，对于胚胎干细胞的鉴定、分离以及自我更新和分化机制的研究，有着十分重要的意义。目前常用的胚胎干细胞特异性标志包括转录因子OCT4、NANOG、REX1等；表面标志物SSEA-1、SSEA-3、TRA-1-60、CD9等；这些胚胎干细胞标志物相应抗体，已被广泛应用于干细胞检测试剂盒，用于干细胞的鉴定与分离。

目前大量研究结果表明，大部分已应用于检测试剂盒的胚胎干细胞特异性标志物抗体并不是直接从胚胎干细胞获得的，例如SSEA-1、SSEA-4、TRA-1-60等抗体是由畸胎瘤细胞免疫获得的；SSEA-3抗体是从小鼠胚胎免疫获得；OCT4、NANOG这些转录因子的抗体则直接使用蛋白作为免疫原免疫动物所获得的。而且这些标志物的特异性有一定的局限性：它们在一些成体干细胞、正常组织或癌细胞中也有一定表达，胚胎干细胞特异性的膜表面标志数量更是有限。因此，开发更灵敏、特异性更高的胚胎干细胞鉴定试剂意义重大。

发明内容

本发明的目的是提供一种新型的胚胎干细胞特异性标志物Aire及其应用。

为了实现本发明目的，本发明的一种胚胎干细胞特异性标志物Aire（自身免疫调节因子），其氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，或该序列经替换、缺失或添加一个或几个氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列。

为了实现本发明目的，本发明的一种胚胎干细胞特异性标志物Aire（自身免疫调节因子），其氨基酸序列如SEQ ID No.2所示，或该序列经替换、缺失或添加一个或几个氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列。

本发明还提供一种胚胎干细胞特异性标志物Glut3（葡萄糖转运蛋白3），其氨基酸序列如SEQ ID No.3所示，或该序列经替换、缺失或添加一个或几个氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列。

本发明还提供一种胚胎干细胞特异性标志物GM-CSFRα（粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子受体α链），其氨基酸序列如SEQ ID No.4所示，或该序列经替换、缺失或添加一个或几个氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列。

本发明直接以胚胎干细胞作为免疫原，免疫兔子，分离兔子脾脏细胞，与骨髓瘤细胞融合，分别筛选出产生Glut3兔单克隆抗体和GM-CSFRα兔单克隆抗体的杂交瘤细胞，应用于干细胞的鉴定与分离。

本发明还提供一种鉴定胚胎干细胞的方法，以Aire、Glut3和GM-CSFRα中的至少一种作为鉴定胚胎干细胞的标志物。Aire只在胸腺组织的极少量细胞中被检测到，其他标志物Nanog、Oct4等在许多肿瘤细胞上均能被检测到。Aire作为胚胎干细胞鉴定标志物，相比Nanog、Oct4等常规标志物，特异性更好。Glut3可作为胚胎干细胞功能性鉴定标志物。Glut3和GM-CSFRα兔单克隆抗体识别天然构象表位，除鉴定胚胎干细胞全能性以外，可同时用于检测干细胞活性。

本发明还提供胚胎干细胞特异性标志物Aire、Glut3和/或GM-CSFRα在鉴定胚胎干细胞中的应用，用Aire单克隆抗体、Aire多克隆抗体、Glut3单克隆抗体和GM-CSFRα单克隆抗体中的至少一种通过检测抗原抗体相互作用来鉴定胚胎干细胞。所述Aire多克隆抗体的制备方法为：分别合成由SEQ ID No.1所示的Aire序列C末端的21个氨基酸组成的多肽（其序列为ILQWAIQSMSRPLAETPPFSS）以及由SEQ ID No.2所示的Aire序列C末端的12个氨基酸组成的多肽（其序列为QSMARPAAPFPS）；分别将多肽偶联载体蛋白KLH，即为完全抗原；将完全抗原与完全弗氏佐剂混合，免疫新西兰大白兔；首免后，每隔两周加强免疫；四免后取全血，分离兔血清中的Aire兔多克隆抗体。所述Glut3单克隆抗体和GM-CSFRα单克隆抗体分别由杂交瘤细胞株ZJUESRMAB39（保藏号CGMCC NO.7301）和ZJUESRMAB29（保藏号CGMCC NO.7302）产生。检测抗原抗体相互作用的方法，例如免疫细胞化学法ICC、IHC染色或免疫共沉淀等。