[发明专利]增强β-环糊精葡萄糖基转移酶产β-环糊精能力的突变方法

说明书

技术领域

增强β-环糊精葡萄糖基转移酶产β-环糊精能力的突变方法，本发明属于基因工程和酶工程领域。本发明是利用定点突变方法增强环糊精葡萄糖基转移酶产物特异性的技术。

背景技术

环糊精是由D-吡喃葡萄糖通过α-1，4-糖苷键连接而成，具有环状中空圆锥形结构，其中以6、7和8个葡萄糖单元所构成的α-、β-和γ-环糊精最为常见。由于具有外亲水、内疏水的特性，环糊精能与许多疏水客体分子形成包合物，从而改变客体分子的理化性质，因此，在食品、医药等工业领域中有着广泛的应用。

环糊精的工业化生产均采用酶法工艺，即在环糊精葡萄糖基转移酶(CGT酶)催化作用下通过环化反应转化淀粉所合成。由于野生CGT酶作用淀粉所得产物均为α-、β-和γ-环糊精的混合物，给单一类型环糊精产物的分离和纯化带来很多不便。目前，工业上分离β-环糊精的方法通常为选择性结晶或有机溶剂络合。

本发明中所使用的来源于环状芽孢杆菌(Bacillus circulans)STB01的β-CGT酶主要以生成β-环糊精为主，但环化产物中α-和γ-环糊精仍占有较大比例，因此，进一步提高该酶产β-环糊精的能力，将更加有利于β-环糊精的工业化生产。

发明内容

本发明的目的是提供进一步提高B.circulans STB01CGT酶产β-环糊精能力的突变方案。

本发明的另一个目的是提出增强β-CGT酶产β-环糊精能力的突变体A31R、A31P和A31T，及其构建方法。

本发明的技术方案：

来源于B.circulans STB01的CGT酶的三种突变体A31R、A31P和A31T，将CGT酶中第31位丙氨酸分别突变成精氨酸(Arg)、脯氨酸(Pro)或苏氨酸(Thr)，它们相比于野生型CGT酶具有更高的产β-环糊精能力。

所述的三种突变体A31R、A31P和A31T的制备方法，根据B.circulans STB01CGT酶的基因序列，分别设计并合成引入Arg31、Pro31和Thr31密码子的突变引物，对基因进行定点突变，测定DNA序列，分别鉴别出Ala31密码子变成Arg31密码子，Pro31密码子及Thr31密码子的突变基因，并在枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)WB600中进行表达。

(1)定点突变

利用快速PCR技术，以含野生CGT酶基因的表达载体pST/cgt为模板进行定点突变。

引入Arg31密码子的定点突变引物：

正向引物：5’-GACGGCAATCCCCGCAACAATCC-3’，下划线为突变碱基，

反向引物：5’-GGATTGTTGCGGGGATTGCCGTC-3’，下划线为突变碱基；

引入Pro31密码子的定点突变引物：

正向引物：5’-GACGGCAATCCCCCCAACAATCC-3’，下划线为突变碱基，

反向引物：5’-GGATTGTTGGGGGGATTGCCGTC-3’，下划线为突变碱基；

引入Thr31密码子的定点突变引物：

正向引物：5’-GACGGCAATCCCACCAACAATCC-3’，下划线为突变碱基，

反向引物：5’-GGATTGTTGGTGGGATTGCCGTC-3’，下划线为突变碱基。

PCR反应体系均为：5×PrimeSTAR Buffer(Mg²⁺Plus)10μL，dNTPs(各2.5mM)4μL，正向引物(10μM)1μL，反向引物(10μM)1μL，模板DNA1μL，PrimeSTAR HS DNA Polymerase(2.5U/μL)0.5μL，加入双蒸水32.5μL。

PCR反应扩增条件均为：PCR扩增条件均为：98℃预变性4min；随后98℃10s，55℃15s，72℃8min进行35个循环；最后72℃保温10min。