[发明专利]一种烟草花粉冷冻真空干燥、低温中长期保存方法

说明书

技术领域

本发明涉及农作物花粉储藏方法，特别涉及一种适用于烟草等作物的花粉冷冻干燥低温中长期保存方法。 

背景技术

在烟草雄性不育杂交一代种子制种过程中，有效地克服父母本花期不遇、保证活力高、数量充足的花粉供应，是获得高质量烟草种子和提高种子产量的重要前提条件和保证。传统的烟草雄性不育杂交一代种子制种技术是采用新鲜父本花粉直接给母本授粉，花粉活力高、效果好，但若母本生育期短、开花早，而父本生育期长、开花晚，则易造成母本满园花等待父本花粉的误花现象，虽然在种子生产上普遍采用适当多栽父本和父本早移栽等措施，有效地缓解了父本母本花期不遇的难题，但因授粉方式仍采用新鲜父本花粉直接给母本授粉，一是父本种植量大增加生产成本，二是过剩的花粉，因其寿命短(室温下24小时活力下降50％-80％)，无妥当的贮藏方法，造成大量浪费。特别是遇到阴雨天无法授粉时，父本花朵浪费更为严重。 

如何将花粉(包括上年花粉)采用一种适宜的储藏方法长期保存起来，然后等到母本花开时，将保存的父本花粉拿出去进行授粉，已成为烟草杂交制种中急需解决的关键技术。虽然关于烟草花粉贮藏方法研究有少量报道，但目前用于生产的仅是保鲜冰箱短期保存和液氮中长期保存法，如《中华人民共和国烟草行业标准烟草种子雄性不育系种子生产技术规程(YC/T  367-2010)》中规定，是将花粉密封置于4℃下短期贮藏，或用冻存管封存于液氮中长期贮藏。《一种烟草雄性不育系种子的繁殖方法》(CN101731140A)是将花粉在3～5℃的冰箱内封存备用。保鲜冰箱保存法，保存时间短，一般是20-30天；而液氮保存法，需常添加液氮，成本较高，加之液氮来源、运输的局限，限制了该方法的应用。 

花粉贮藏条件和其它生命体贮藏一样，一是水分控制，二是温度控制。冷冻真空干燥技术其原理是使生物体完全冻结，在一定的真空条件下使冻晶升华，从而达到低温脱水的目的，其优点是干燥彻底，能排查95-99％的水分，保持了生物原有形态、生理机能。现已广泛用于菌种、疫苗、生物高分子、血清及一些医药产品等保存。截止目前未见将其用于烟草花粉贮藏的报道。将冷冻真空干燥技术应用于烟草花粉贮藏，首先要解决花粉的预冻方法、冷冻干燥方法，其次是冷冻后的花粉贮藏方法和经冷冻、贮藏后花粉的活力恢复方法，而每个步骤的均会影响花粉的活力，目前并没有一套完整技术方案来实现烟草花粉冷冻真空技术。 

发明内容

本发明根据现有技术的不足，经过反复研究发明了一种从花粉预冻数量、预冻时间、冷冻干燥温度、冷冻干燥时间、冷冻干燥后的花粉长期贮藏方式，到贮藏后的花粉应用于授粉前的活力恢复方式等一整套系统方法，本发明操作简单，设备一次投入多年使用，采用该方法保藏的花粉，活力强，田间授粉的坐果率高，种子生产的综合成本大幅降低。 

本发明的技术方案：一种烟草花粉冷冻真空干燥、低温中长期保存方法，其特征在于具体步骤如下： 

(1)新鲜花粉的预冻处理：将新鲜花粉装入花粉储存容器中，并加盖，置于冷冻干燥机的冷阱内预冷冻2-4小时，冷冻干燥机的温度设定在-45℃至-50℃；预冻的目的是使花粉细胞内的自由水凝结到细胞间隙形成冰晶，瓶内花粉厚度越厚，要求冷冻温度越低、冷冻时间越长； 

(2)花粉的真空干燥处理：将步骤(1)中装有新鲜花粉经过预冻处理的花粉储存容器取出，去盖后将花粉倒出平摊在专用干燥盘内放入冷冻干燥机的干燥架上，或直接平摊在冷冻干燥机的物料盒中，合上密封罩，启动冷冻干燥机，当冷阱温度达-40℃至-50℃时，开始抽真空，要求在0.4-0.6小时内达到真空度达到10Pa以下，真空度低于10Pa均可实现真空干燥，一般情况下真空度越小真空干燥效果越好，冷冻干燥的时间为8-12小时，冷冻干燥时的温度设定在-40℃至-50℃； 

(3)花粉的低温贮藏：将步骤(2)中经冷冻真空干燥处理后的花粉取出，放入花粉贮藏瓶或花粉储藏袋中，并将其密封，置于温度-4℃至-18℃的冷冻冰柜内低温长期保存至授粉期； 

(4)花粉的复水处理：在需要授粉时，将步骤(3)中长期保存在冷冻冰柜内的花粉取出，撤出封口，并在室温下，用蒸馏水或0.9％生理盐水复水浸泡花粉15-20分钟，然后迅速摊开自然风干，或在生物培养箱中温度25-30℃、相对湿度95％以上的条件下吸水20-30分钟，或在温度30-35℃的水溶锅中吸水15-30分钟后，便可完全复水，恢复花粉活力。