[发明专利]多种抗原免疫高通量制备单克隆抗体及其杂交瘤细胞株的方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及多种抗原免疫高通量制备单克隆抗体及其杂交瘤细胞株的方法。

背景技术

随着蛋白质组学研究的发展，数以千计的蛋白需要用亲和试剂如单克隆抗体进行进一步的功能验证，如蛋白的定性、定量分析、蛋白质的分离纯化、功能验证、蛋白质间的相互作用验证及蛋白翻译后修饰的识别等。

单克隆抗体技术是产生具有蛋白质识别功能的高度特异性抗体的基本方法，因此，单克隆抗体在蛋白质的研究中已经成为必不可少的工具。然而传统的单抗制备耗时长、效率低，许多文章报道了在提高单克隆抗体生产速度和通量方面所做的尝试。Ning等人采用组份化的血浆蛋白免疫小鼠，然后用免疫沉淀/质谱法鉴定相应的抗原。一些研究者采用蛋白混合物免疫小鼠然后用蛋白芯片和流式细胞术鉴定相应的抗原，另外也有一些不依赖于细胞融合的方法，如重组抗体及噬菌体展示制备抗体的报道。

不同的抗体适用于不同的检测方法（如免疫印迹法、免疫沉淀法，免疫组织化学法、免疫荧光法及流式细胞术等等），所以需要更多的抗体以适应不同的需求。为满足这种需要，建立高通量快速获得单克隆抗体的方法是十分必要的。

在之前的研究中曾用四种已知蛋白免疫小鼠并用ELISA法及蛋白芯片对单克隆抗体进行筛选，但是免疫和筛选的种类还是不够多。

发明内容

本发明的目的是提供一种利用多种抗原免疫高通量制备分泌特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞株的方法。

本发明的方法，包括如下步骤：

1）用n种目标蛋白的混合物作为免疫抗原免疫小鼠，得到免疫后小鼠；

n大于4且小于15；

所述n种目标蛋白的混合物为将n种目标蛋白混合，得到的混合物；

2）收集处死后的步骤1）所得免疫小鼠的离体脾细胞；将所述脾细胞与骨髓瘤细胞融合，得到融合细胞；

3）对所述融合细胞进行第一轮ELISA检测，选取发生免疫阳性反应的杂交瘤细胞；

所述第一轮ELISA检测中，将所述n种目标蛋白混合物包被作为抗原、一抗为所述融合细胞的细胞培养上清液、二抗为抗小鼠IgG的抗体；

4）将所述第一轮ELISA检测中发生免疫阳性反应的杂交瘤细胞进行第二轮ELISA检测，选取针对单一抗原发生免疫阳性的杂交瘤细胞株，即为分泌特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞；

所述第二轮ELISA检测中，将n种目标蛋白均单独包被作为抗原、一抗为所述在第一轮ELISA检测中发生免疫阳性反应的杂交瘤细胞的细胞培养上清液、二抗为抗小鼠IgG的抗体；

所述单一抗原为n种目标蛋白中任一种。

所述分泌特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞为如下杂交瘤细胞中的一种或几种：分泌抗蛋白1的单克隆抗体的杂交瘤细胞、分泌抗蛋白2的单克隆抗体的杂交瘤细胞、……、分泌抗蛋白n的单克隆抗体的杂交瘤细胞。

上述方法中，所述n种目标蛋白混合为等质量混合；

所述n种目标蛋白之间的同源性小于34%，所述n种目标蛋白之间的同源性为9-34%；

所述目标蛋白为不含标签的目标蛋白或含有标签的目标蛋白；若作为免疫抗原的目标蛋白为不含标签的目标蛋白，则所述第一轮ELISA检测和第二轮ELISA检测中作为抗原的目标蛋白为不含标签的目标蛋白或含有标签的目标蛋白；

若作为免疫抗原中的目标蛋白为含标签A的目标蛋白，则所述第一轮ELISA检测和第二轮ELISA检测中作为抗原的目标蛋白为含标签B的目标蛋白；且所述标签A和所述标签B不同。

上述方法中，步骤1）中，所述免疫包括如下步骤：

A、将所述免疫抗原首次免疫小鼠，得到首免小鼠；

B、将所述免疫抗原加强免疫所述首免小鼠，得到免疫小鼠；

所述加强免疫的时间为首次免疫第10-20天，所述加强免疫的时间具体为首次免疫第11天，将首次免疫开始记作第1天；

步骤1）中，所述首次免疫的免疫抗原的量为每250ul免疫抗原中含有质量均为10μg的8种含有HIS标签的重组抗原蛋白；

所述加强免疫的免疫抗原的量为每250ul免疫抗原中含有质量均为10μg的8种含有HIS标签的重组抗原蛋白；

所述免疫抗原中的n种抗原蛋白等质量混合；