[发明专利]一种具有高稳定性和高特异性的葡萄糖脱氢酶细菌表面展示系统及其制备和应用

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体的说是一种具有高稳定性和高特异性的葡萄糖脱氢酶细菌表面展示系统及其制备和应用。 

背景技术

葡萄糖脱氢酶(GDH)(EC1.1.1.47)广泛参与生物体中的葡萄糖代谢途径，特别是芽孢杆菌在芽孢形成阶段的关键酶。借助于辅酶NAD(P)⁺，葡萄糖在GDH的催化下被氧化成葡萄糖酸内酯，辅酶NAD(P)⁺则被还原为NAD(P)H。自二十世纪八十年代起，研究人员就已经克隆了来源于芽孢杆菌的GDH，并在大肠杆菌中进行了高效表达。 

来源于芽孢杆菌的葡萄糖脱氢酶属于短链脱氢酶/还原酶家族(short-chain dehydrogenase/reductase，SDR)，是由四个相同的亚基组成的四聚体蛋白，单体的分子量约为30kDa。野生型的GDH热稳定性和pH稳定性都不理想，因此，在实际应用上受到了一定的限制。鉴于此，研究人员开始对编码GDH的基因进行体外定向进化的研究，Makino和Nagao等人采用化学诱变的方法对来源于Bacillus megaterium IWG3的葡萄糖脱氢酶进行了突变，得到了多株热稳定性提高的突变体，其中E96A的热稳定性最高，与野生型相比提高了约20℃。Baik等人采用DNA重排技术突变来源于Bacillus licheniformis IFO12200，Bacillus megaterium IFO15308，Bacillus subtilis IFO13719和Bacillus megaterium IWG3的一个突变体F20(Q252L)，获得了一个热稳定性显著提高的突变体DN46(E170K/Q252L)，DN46在66℃的半衰期为540分钟，而F20仅为1.3分钟。GDH的三维结构研究表明，突变体通过增强疏水作用和减小离子的排斥作用显著增强了亚基与亚基之间的相互作用力，稳定了酶的三维结构，从而提高了酶的稳定性。在此基础上，Vazquez-Figueroa等人对来自于Bacillus subtilis的葡萄糖脱氢酶进行了有理设计，得到了多个突变体，其中K170/L252突变体的Tm值和野生型相比提高了34.7℃。 

在底物特异性方面，GDH对其天然底物β-D-葡萄糖的特异性并不高，对结构类似的木糖、半乳糖、甘露糖都有较弱的催化作用。研究人员在GDH三维结构研究的基础上，突变了巨大芽孢杆菌IAM1030中IV-GDH的C-末端区域的氨基酸残基，得到了多个突变体，它们对其底物特异性都有很大的影响。 

综上所述，研究者广泛采取随机突变、DNA重排等基因工程的手段，在一定程度上提高了GDH的稳定性和底物特异性，但是这些方法需要将表达 的突变蛋白进行纯化，然后再测定其酶活性，上述过程费时费力，需要昂贵的仪器设备，过程复杂且不易操作，尤其不适用于高通量的突变体筛选。 

微生物表面展示技术是利用基因工程的手段将外源蛋白通过融合适当的锚定蛋白而表达在微生物细胞的表面，例如0mpA、冰核蛋白(ice-nucleation protein，INP)和凝集素等都可以作为锚定蛋白。这种技术被广泛用于蛋白质工程，疫苗设计，疾病诊治，工业和环保等领域。由于被展示的蛋白在细胞表面具有相对独立的空间结构和生物学活性，能够直接与底物进行充分的反应，而且表面展示文库具有高通量、高灵敏度的特点，因此微生物表面展示技术在研究蛋白质生物学功能方面具有很大的应用前景。Tan等利用OprI作为锚定蛋白将聚(R)的3-羟基丁酸酯(PHB)解聚酶突变体展示在大肠杆菌的表面，筛选得到酶活性提高的突变体，研究了参与底物识别的关键氨基酸残基。由此可见，微生物表面展示技术是用来研究蛋白功能和特性的一个非常简单、有效的手段。INP是丁香假单胞菌等菌株的外膜蛋白，可催化过冷却水结冰。外源蛋白可与INP融合，通过糖基磷脂酰肌醇而锚定在细菌表面。全长的冰核蛋白包括N端、C端和中间重复序列。与其他锚定蛋白相比，外源蛋白可以在宿主细胞中稳定的表达，而且能够高效的展示在细菌表面。 

Quikchange定点突变技术是通过设计含有突变位点的引物，利用PCR反应，以质粒为模板，在高保真DNA聚合酶的作用下进行延伸，得到含有突变位点的DNA双链质粒，这种质粒是未甲基化的，而大肠杆菌自身的质粒DNA是甲基化的，这样就可以通过DpnI酶消化去除原始模板，最后得到突变的质粒，经过转化得到突变的菌株。该技术操作简便，效率高，现已成功用于各种突变体的构建。 

发明内容